Utilize este identificador para referenciar este registo: http://hdl.handle.net/10362/19257
Título: Analysis of changes in the host cell proteome during hepatitis D virus Infection
Autor: Mendes, Marta Maria Lavouras
Orientador: Cunha, Celso
Coelho, Ana
Palavras-chave: Biologia Molecular
Hepatite Delta
Ciências Biomédicas
Data de Defesa: 2011
Resumo: O virus da hepatite delta (HDV) é um vírus muito simples que apresenta um genoma circular de RNA de cadeia simples com 1.7 Kb, codificando apenas para uma proteina – o antigénio delta (HDAg/ Ag). A replicação ocorre no núcleo por um mecanismo de círculo rolante usando a RNA polimerase II do hospedeiro, originando RNA genómico e antigenómico e um RNA 5‟-capped e poliadenilado que funciona como RNA mensageiro. Durante a replicação a ocorrência de um mecanismo de editing leva à extensão da grelha de leitura e consequentemente à produção de uma segunda forma do antigénio delta. Apesar da sua simplicidade, pouco se sabe sobre que factores e/ou mecanismos do hospedeiro são usados pelo virus durante a sua replicação e patogénese, devido à falta de modelos de estudo adequados. Num trabalho anterior, verificou-se que as proteínas HSP105 e hnRNP H se econtravam diferencialmente expressas durante a replicação do HDV. Vários ensaios foram então efectuados para determinar se e como poderão essas proteínas estar envolvidas na replicação do HDV. Mais ainda, usando un novo modelo de replicação para o HDV baseado numa linha celular induzida por tetraciclina, determinaram-se as alterações causadas pela replicação do HDV no proteoma destas células. Nesta linha celular o Ag foi colocado sobre o controlo do promotor da tetraciclina originando a linha celular 293- Ag. Esta linha foi posteriormente transitoriamente transfectada com os RNAs do HDV dando origem ás células 293-HDV, que permitem a replicação do virus. Usando esta linha celular e as células 293-HDV e uma aproximação de proteómica quantitativa baseada em espectrometria de massa consistindo na marcação enzimática com 16O/18O juntamente com biologia de sistemas, determinaram-se as alterações nos proteomas das células durante a replicação do HDV de forma a clarificar os mecanismos de replicação e patogénese do virus. Os resultados mostraram que de facto as proteínas HSP105 e hnRNP H afectam a replicação do HDV. O silenciamento da proteína HSP105 parece induzir uma diminuição da expressão da proteína LHDAg e um aumento dos níveis de mRNA do HDV. Verificou-se ainda que a proteína HSP105 se liga à proteína LHDAg. A proteína HSP105 parece estar envolvida no transporte ou ligação da ribonucleoproteina (RNP) viral ao retículo endoplasmático ou mesmo na formação das patículas virais. Quanto à proteína hnRNP H, o seu silenciamento parece induzir um aumento dos níveis de mRNA do HDV e uma diminuição da expressão dos antigénios delta. Verificou-se ainda que a proteína hnRNP H se liga à SHDAg. A proteína hnRNP H parece ser recrutada pelo HDV induzindo splicing alternativo de pre-mRNAs que posteriormente irão originar proteínas chave, essenciais para a replicação viral. Para determinar quais as alterações no proteoma das células do hospedeiro durante a replicação do HDV, cinco comparações de proteomas, entre controlos e ensaios, foram efectuadas. Aproximadamente 1000 proteínas por ensaio foram identificadas, das quais cerca de 600 foram quantificadas. Finalmente, 88 proteínas foram encontradas diferencialmente expressas durante a replicação do HDV. Uma análise mais superficial mostrou que a maioria das proteínas diferencialmente expressas estavam envolvidas no metabolismo de proteínas e nas vias energéticas. Uma análise mais profunda foi posteriormente efectuada usando o GOTM e o IPA permitindo determinar as interacções entre as proteínas diferencialmente expressas e quais as vias canónicas mais alteradas durante a replicação do HDV. Os resultados mostraram que várias vias metabólicas e proteínas chave estão envolvidas na replicação do HDV. Três das vias mais afectadas são a respiração anaeróbica, a via de simalização HIF1a e a regulação do checkpoint na fase G2/M. Esta última via é de extrema importância uma vez que leva a uma divisão celular descontrolada.
URI: http://hdl.handle.net/10362/19257
Designação: Dissertation to obtain the PhD degree in Molecular and Cellular Biology
Aparece nas colecções:IHMT: MM - Teses de Doutoramento

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