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Publicação
Nanopartículas de ouro anisométricas como nanossondas para a identificação do polimorfismo de DNA associado à Intolerância à Lactose
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Orientador(es)
Resumo(s)
O diagnóstico da intolerância à lactose, enquanto condição genética ancestral ou predisposição representa atualmente uma das grandes preocupações da Nutrigenética em Portugal. A entrada em vigor de regulamentação ditou a proibição da venda direta ao público de testes genéticos relacionados com a saúde, passando a ser exclusiva por prescrição médica, o que acarretou um aumento dos preços. Perante esta conjuntura surge a necessidade de desenvolver metodologias alternativas de baixo custo e acesso facilitado que permitam o rastreio da intolerância à lactose. De acordo com os interesses comerciais da empresa STAB VIDA, Lda., selecionou-se como alvo de estudo, o polimorfismo de base única (SNP) C/T -13910 presente no gene LCT, sendo que para além da proposta de dois tipos de biossensores com base em nanopartículas de ouro (em solução e em chip), o protocolo de sequenciação de Sanger utilizado para a identificação do genótipo de amostras clínicas foi igualmente otimizado, com vista na diminuição dos custos inerentes ao atual serviço.
O biossensor desenvolvido em solução possibilitou a deteção colorimétrica do alvo em
amostras clínicas de DNA (produtos PCR) com resolução ao nível de uma base, seguindo uma abordagem non-crosslinking. Recorreu-se a “nanossondas de ouro” resultantes da síntese e funcionalização de nanopartículas de ouro esféricas (15 nm) ou anisométricas (nanoestrelas) com oligonucleótidos tiolados, cuja sequência era especifica ao alvo de interesse. O principio de deteção consistiu na alteração das propriedades óticas através da força iónica, provocando a agregação das nanossondas. A agregação diferencial colorimétrica decorrente do deslocamento da LSPR foi detetado por espetrofotometria ultravioleta-visível e em determinados casos, a “olho nu”, dada a forte coloração das soluções.
Em chip (plataformas de vidro de borossilicato), a deteção de eventos de hibridação de DNA efetuou-se com base na alteração do índice de refração de nanopartículas de ouro. Foram sintetizadas nanopartículas de ouro esféricas (80 nm) ou anisométricas (nanotriângulos), tendo sido posteriormente depositadas e funcionalizadas com oligonucleótidos tiolados e com mercaptohexanol, passando a designarem-se por “chip-sondas”. Todas as alterações efetuadas à superfície das nanopartículas foram
avaliadas de forma individual e localizada, isto é, foram selecionadas através de microscopia de campo escuro e o seu espetro ultravioleta-visível adquirido. A interação ou ligação de oligonucleótidos de DNA com diferentes sequências (complementares ou não) à sonda, provocaram alterações no índice local de refração das nanopartículas, refletindo-se em deslocamentos da LSPR. A otimização das condições experimentais inerentes à preparação dos chips-sonda e à reação de hibridação foi efetuada com DNA sintético, tendo-se validado o desempenho de ambos os nanobiossensores com produtos PCR.
Descrição
Palavras-chave
Intolerância à lactose Nanopartículas de ouro Nanopartículas anisométricas Biossensor Espetrofotometria de UV-Vis Microscopia de campo escuro