Antimalarial resistance in Mozambique: characterization of molecular markers and assessment of Plasmodium falciparum susceptibility to artemisinin based combination therapy

Abstract

Introdução: A malária continua a ser um dos mais graves problemas de saúde pública na África Subsaariana e Moçambique é o quarto maior contribuinte mundial, com 4,7% dos casos da doença e 3,6% do total de mortes devido à malária. O seu controlo assenta no combate ao vetor e no tratamento dos casos confirmados com medicamentos antimaláricos. A vigilância molecular da malária é um instrumento importante para monitorizar a propagação da resistência aos medicamentos antimaláricos. O principal objetivo deste estudo foi estudar a resistência aos ACTs através da caraterização de marcadores moleculares e da avaliação da suscetibilidade ex vivo do Plasmodium falciparum aos medicamentos antimaláricos administrados em Moçambique. Métodos: Este projecto de tese consistiu em estudos transversais ao longo do pais incluindo ensaios de susceptibilidade do P. falciparum aos farmacos e a genotipagem. Os ensaios de suscetibilidade foram realizados em 43 amostras positivas para malária não complicada na província de Maputo entre maio e julho de 2022. Adicionalmente, o perfil dos polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) pfk13 e pfmdr1, bem como a variação do número de cópias (CNV) pfpm2 e pfmdr1 de isolados fenotipicamente suscetíveis aos antimaláricos foi avaliado por sequenciação de Sanger e reação em cadeia da polimarase quantitativa em tempo real (qPCR), respetivamente. Paralelamente, com o objetivo de caraterizar marcadores moleculares de resistência aos antimaláricos, foi realizado um estudo transversal que recrutou ~600 participantes com infeção por malária detectada por Testes de Diagnóstico Rápido (TDR), de três locais de estudo diferentes (Niassa, Manica e Maputo) entre abril e agosto de 2021. O software SIFT (Sorting Intolerant from Tolerant) foi utilizado para prever se uma substituição de aminoácidos afecta a função da proteína Kelch 13. Resultados: Quanto aos ensaios de susceptibilidade, as taxas de sobrevivência revelaram a ausência de parasitas sobreviventes quando expostos a 700 nM de diidroartemisinina (DHA), 200 nM de piperaquina (PPQ) e amodiaquina (AQ). As taxas foram inferior a 1%, 10% e 45%, que são os limiares para ring stage susceptibility assay (RSA), piperaquine susceptibility assay (PSA) e amodiaquine susceptibility assay (AQSA), respetivamente. Quanto à genotipagem, não foi detectada qualquer mutação validada no gene de resistência à artemisinina, pfk13, nos locais do estudo. No entanto, foram detectadas mutações não sinónimas com uma prevalência de 10,2%, 6% e 5% em Niassa, Manica e Maputo, respetivamente. 56,3% das mutações não-sinónimas registadas deveu-se à substituição na primeira base do codão, 25% na segunda base e 18,8% na terceira base. Além disso, 50% das mutações não-sinónimas apresentaram um SIFTscore inferior ao limiar, 0,05, pelo que se previu que fossem deletérias. Após a ddPCR detectou-se CNVs de pfpm2 e pfmdr1 em 5,7% (13/229) das amostras de alta qualidade. Conclusão: Os parasitas em circulação nos locais estudados continuam a apresentar uma elevada sensibilidade aos antimaláricos, sem mutações associadas à resistência à artemisinina e ao seu parceiro. A monitorização contínua da suscetibilidade do parasita aos ACT e a vigilância molecular devem ser intensificadas para reduzir as hipóteses de resistência à artemisinina num futuro próximo.

ABSTRACT Introduction: Malaria remains one of the most serious public health problem in sub-Saharan Africa and Mozambique is the world's fourth largest contributor, with 4.7% of disease cases and 3.6% of total deaths due to malaria. Its control relies on the fight against the vector and treatment of confirmed cases with antimalarial drugs. Malaria Molecular surveillance is an important tool for monitoring the spread of antimalarial drug resistance. The main goal of this PhD thesis was to study Plasmodium falciparum resistance to ACTs by characterizing molecular markers and assessing its ex vivo susceptibility to antimalarial drugs administered in Mozambique.Methods: Ex vivo P. falciparum susceptibility assay was performed in 43 non-complicated positive malaria samples from Maputo province between May and July 2022. Additionally, the profile of pfk13 and pfmdr1 single-nucleotide polymorphisms (SNPs), as well as pfpm2 and pfmdr1 copy number variation (CNV) from isolates phenotypically susceptible to antimalarials was assessed by Sanger sequencing and quantitative polimarase chain reaction (qPCR) respectively. Additionally, a cross-sectional study was conducted with the objective of characterising antimalarial resistance molecular markers. The study recruited approximately 600 participants with malaria infection, detected by rapid diagnostic tests (RDT), from three different study sites (Niassa, Manica and Maputo) between April and August 2021. To achieve the second objective, a novel, medium-throughput, quadruplex droplet digital PCR (ddPCR) assay was developed to simultaneously quantify the copy number of pfpmp3, pfpmp2, and pfmdr1 loci in the clinical samples. Sorting Intolerant from Tolerant software was employed to predict the impact of amino acid substitutions on Kelch 13 protein function. Results: Survival rates revealed the absence of surviving parasites when exposed to 700 nM of dihydroartemisinin (DHA), 200 nM of piperaquine (PPQ) and amodiaquine (AQ). The survival rate was less than 1%, 10% and 45%, which are the thresholds for RSA, PSA and AQSA, respectively. As for molecular characterization of resistance markers, no pfkelch13-mediated artemisinin resistance gene mutation was detected in our study settings. However, non-synonymous mutations were detected at prevalence of 10.2%, 6% and 5% in Niassa, Manica and Maputo, respectively. Most (56.3%) of the reported non-synonymous mutations were due to substitutions at the first base of the codon, 25% at the second base and 18.8% at the third base. Additionally, 50% of non-synonymous mutations showed a SIFTscore below cut off value of 0.05, therefore, they were predicted to be deleterious. Following ddPCR and the application of quality control standards, we detected CNVs in 13 of 229 high-quality samples (prevalence of 5.7%). Overall, our study showed a low level of resistance CNVs present in the parasite population across all three-collection sites, including various combinations of pfmdr1, pfpmp2, and pfpmp3 CNVs. Conclusion: These results suggested that P. falciparum isolates from studied settings are still showing high sensitivity to antimalarial, with no mutations associated to artemisinin and its partner drug resistance. Continued monitoring of parasite susceptibility to ACTs and molecular surveillance should be intensified to reduce chances of artemisinin resistance in the near future.