Gut microbiome analysis in patients with Sickle Cell Disease

Abstract

RESUMO A anemia falciforme (AF) é uma das doenças monogénicas hereditárias mais comuns mundialmente, afetando mais de 300,000 recém-nascidos todos os anos e contribuindo até 90% da mortalidade em crianças com menos de 5 anos na África Subsariana. As manifestações clínicas são altamente heterogéneas e o microbioma intestinal parece ser essencial numa variedade de processos, como a modulação da inflamação, adesão celular e indução de neutrófilos maduros, um dos principais intervenientes das crises vaso-oclusivas recorrentes. Tendo estes aspetos em consideração, o objetivo principal deste trabalho foi demonstrar a influência do microbioma intestinal na AF. Para tal, os nossos objetivos específicos foram: caracterizar o microbioma intestinal de pacientes com AF quando comparado com um grupo controlo; investigar a influência do fármaco mais utilizado nesta doença, a hidroxiureia, no microbioma desta população; verificar o impacto das moléculas de adesão na composição microbiana; estudar a relação entre a presença de parasitas intestinais e microbioma, e o seu efeito na sintomatologia. Um total de 113 amostras fecais foram colhidas de 40 crianças angolanas com AF antes do tratamento com hidroxiureia (HU), 33 depois e 40 de um grupo controlo de irmãos saudáveis. Várias metodologias foram adotadas neste estudo, tais como: sequenciação 16S rRNA para análise do microbioma, medição de moléculas de adesão solúveis no sistema Luminex MAGPIX e qPCR em tempo real para a deteção de oito parasitas intestinais. Algumas diferenças microbianas notáveis foram reportadas neste estudo, tais como uma menor abundância de Blautia e uma maior prevalência de Clostridium XI nas crianças com AF comparativamente com as do grupo controlo. Após os seis meses de tratamento com HU, as crianças com AF possuíam uma proporção mais alta de diversas bactérias produtoras de ácidos gordos, essenciais na modulação da inflamação. Adicionalmente, diversas bactérias do género Clostridium estavam positivamente correlacionadas com os níveis de leucócitos, neutrófilos, algumas moléculas de adesão e negativamente correlacionadas com os níveis de hemoglobina fetal. Finalmente, demonstrámos que a presença de certos parasitas diminui a prevalência de uma variedade de bactérias benéficas como: Lactobacillus, Bifidobacterium, Cuneatibacter, Bacteroides uniformis, Roseburia and Shuttleworthia. O presente trabalho analisou pela primeira vez o microbioma de uma população angolana com AF, mas ainda há muito a aprender antes de confiarmos plenamente nas abordagens terapêuticas de modulação intestinal, sendo por isso essencial efetuar mais investigação nesta área antes de tornar esta abordagem uma realidade para utilização generalizada.

ABSTRACT Sickle cell disease (SCD) is one of the most common inherited monogenic diseases worldwide, affecting more than 300,000 newborns annually and contributing to up to 90% of under-5 mortality in Sub-Saharan Africa. Clinical manifestations are very heterogeneous, and the intestinal microbiome appears to be crucial in a variety of essential processes, such as modulation of inflammation, cell adhesion and induction of aged neutrophils, the main interveners of recurrent vaso-occlusive crisis. With this in mind, the main aim of the present work was to prove the influence of gut microbiome on SCD. In order to achieve this, the specific objectives were: to characterize the gut microbiome of SCD patients when compared with a group of controls; investigate the influence of the most utilized treatment, hydroxyurea (HU), on the gut microbiome of this population; assess the impact of adhesion molecules on microbial composition; study the interplay between the presence of intestinal parasites and microbiome, and if it aggravates SCD symptomology. A total of 113 fecal samples were collected from 40 SCD children before HU treatment, 33 after, and a control group of 40 healthy siblings. A variety of methodologies were adopted, particularly: 16S rRNA sequencing for microbiome analysis, measurement of soluble adhesion molecules in the Luminex MAGPIX system, and real-time qPCR for the detection of eight different intestinal parasites. Some notable microbial differences were reported in this study, namely a lower abundance of Blautia and higher prevalence of the genus Clostridium XI in SCD children when compared to the siblings’ group. After six months of continuous HU treatment, SCD children had higher proportions of several beneficial bacteria, mostly short-chain fatty acids-producing species, essential for inflammation modulation. Moreover, several bacteria from the Clostridium genera were positively correlated with leukocytes, neutrophils levels, and some adhesion molecules, while others were negatively correlated with fetal hemoglobin levels. Finally, we were able to demonstrate that the presence of certain parasites lowered the prevalence of a variety of beneficial bacteria, namely: Lactobacillus, Bifidobacterium, Cuneatibacter, Bacteroides uniformis, Roseburia and Shuttleworthia. The present work was the first microbiota analysis in an Angolan pediatric population with SCD and there is still much to learn before fully relying on therapeutic approaches for gut modulation, which is why more research in this field is crucial to making this a reality.