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Publicação
Fluorinated Ionic Liquids and Nature-inspired Eutectics in Selective Aqueous Biphasic Systems: From Amino Acids to Therapeutic Proteins Purification
| Nome: | Descrição: | Tamanho: | Formato: | |
|---|---|---|---|---|
| 130.59 MB | Adobe PDF |
Autores
Orientador(es)
Resumo(s)
Purification systems for therapeutic proteins are urgently needed in the biopharmaceutical
industry, being one of the bottlenecks in downstream procedures to yield proteins with
high purity, stability, and activity. Processes that provide selectivity and adaptability
while being suitable for a wide range of active biomolecules are required. Protein activity
relies on their three-dimensional structure, which is determined by their interactions
with the surrounding environment. Ionic liquids (ILs), and more recently eutectics,
have emerged as valuable platforms in biological applications for designing task-specific
materials by selecting their anions, cations, and hydrogen-bond donors, allowing finetuning of their properties. Herein, FILs and nature-inspired eutectics (formed between
choline and carnitine salts and natural short-chain carboxylic acids (SCCA), approved
by the EFSA for application as food additives) were used to develop task-specific and
more selective aqueous biphasic systems (ABS) for protein purification. The partition
systems were validated with increasing biomolecule complexity, from simple amino acids,
such as tryptophan (Trp), to conventional proteins, such as lysozyme (Lys) and bovine
serum albumin (BSA), and ultimately to high value therapeutic proteins, such as IFN-𝛼
2b (interferon). A two-way approach was implemented in developing selective ABS,
that are biocompatible with biomolecules, ensuring their activity maintenance. First, the
ABS based on nature-inspired eutectics with PPG400 (a widely accepted biocompatible
polymer used in many biopharmaceutical applications), that respect the parameters of
sustainable chemistry per se, were designed to selectively select the target phase for Trp by
eutectic formation (addition of natural SCCA to the ABS based on choline and carnitine
salts). Second, the task-specific FIL-based ABS were designed to increase selectivity while
still offering a biocompatible medium for proteins. Most biological applications, including
protein purification steps, involve aqueous solutions. Insights were attained into taskspecific FILs that limit the impact of water addition on the IL’s hydrogen-bond accepting
ability, a key factor in obtaining functionalized materials for protein purification. FILs
also enables ABS formation with common protein stabilizers, like sugars. Ultimately, the
FIL-based ABS enabled the simultaneous recovery of IFN-𝛼 2b and albumin in opposing
phases (using BSA as a model; mammalian cell culture supernatants contain IFN-𝛼 2b and albumin). Additionally, the interactions between the proteins and ABS-forming
solutes were studied to understand the surroundings effect on the structure, activity,
and partition behavior of the studied proteins. The designed ABS also enables more
efficient production by replacing macroscale batch ABS with flow-through processes (ABS
in microfluidic setups). A proof-of-concept was attained for the miniaturization of ILbased ABS for the partition of Trp, assessing microtube batch ABS and microfluidic ABS
operation. The outcomes of this thesis demonstrate the feasibility of the proposed ABS to
revolutionize the purification systems for therapeutic proteins, with a strong impact on
the biopharmaceutical sector.
Urge desenvolver sistemas de purificação de proteínas de alto interesse para a indústria, pois esta etapa constitui um dos maiores bottleneck na produção de biomoléculas com elevada pureza, estabilidade e atividade funcional utilizadas na produção de biofármacos. São necessários processos que ofereçam alta especificidade adaptabilidade e que sejam aplicáveis a uma vasta gama de biomoléculas ativas. A atividade funcional de uma proteína depende de sua estrutura tridimensional, a qual é imposta pelas suas interações com o ambiente envolvente. Os líquidos iónicos (LIs) e, mais recentemente, as misturas eutécticas, emergiram como plataformas valiosas para as aplicações biológicas onde é possível uma completa personalização dos materiais através da criteriosa seleção de aniões, catiões, dadores de pontes de hidrogénio. Assim, líquidos iónicos fluorados (LIFs) e misturas eutécticas inspiradas na natureza (formadas pela mistura de sais de colina ou carnitina com ácidos carboxílicos naturais de cadeia curta (ACCC), aprovados aditivos alimentares pela EFSA) foram usados para desenvolver sistemas aquosos bifásicos (SAB) seletivos para purificação de proteínas. Os sistemas de partição foram validados num crescente incremento de complexidade das biomoléculas estudadas. A partir de simples aminoácidos, como o triptofano (Trp), passando por proteínas de utilização convencional, como a lisozima e o soro bovino de albumina (BSA), e finalmente chegado a proteínas de elevado valor acrescentado e com relevância na indústria farmacêutica, como é o caso do Interferão-alpha 2b (IFN). No desenvolvimento de SAB mais seletivos e biocompatíveis foram tidas em conta duas direções complementares, garantindo a manutenção da atividade funcional das biomoléculas. Por um lado, o desenvolvimento de SAB compostos por sistemas eutécticos inspirados na natureza e por PPG400 (um polímero biocompatível amplamente usado em aplicações biofarmacêuticas) que respeita os parâmetros da química sustentável por si só e foram projetados para particionar seletivamente TRP para a fase alvo por formação de misturas euteticas (por adição de ACCC ao sistema composto por sais de colina e carnitina). Por outro lado, o desenvolvimento de os SAB baseados em LIF especificamente desenhados para desempenhar uma função e projetados para aumentar a seletividade num meio biocompatível para as proteínas. Considerando que a maioria das aplicações biológicas, incluindo etapas de purificação de proteínas, envolve soluções aquosas. É de grande relevância a conclusão inferida sobre estes líquidos iónicos de que limitam o impacto da adição de água na sua capacidade de aceitação de pontes de hidrogênio, um fator-chave no desenvolvimento de solventes funcionalizados para purificação de proteínas. Os LIFs permitem ainda a formação de ABS com solventes tipicamente utilizados como estabilizadores de proteínas, como açúcares. Por último, o SAB composto por LIF possibilitou a recuperação simultânea de IFN e albumina em fases opostas (usando a BSA como modelo; pois IFN e albumina estão presentes nos meios de cultura de células de mamíferos). Complementarmente, foram estudadas as interações entre as proteínas e os solutos de formação de SAB para entender o efeito do ambiente envolvente na estrutura, atividade e partição das proteínas estudadas. O SAB desenvolvido possibilita ainda uma produção mais eficiente, se substituídos os sistemas de macroescala em batch por operações em continuo (SAB em configurações de microfluídica). Foi alcançada a prova de conceito para a miniaturização de SAB compostos por LIs para a partição de TRP, verificando operações em batch de microtubos e operações de SAB microfluídicos. Os resultados desta tese demonstram a viabilidade do SAB desenvolvido para revolucionar os sistemas de purificação para proteínas terapêuticas, com grande impacto no setor dos biofármacos.
Urge desenvolver sistemas de purificação de proteínas de alto interesse para a indústria, pois esta etapa constitui um dos maiores bottleneck na produção de biomoléculas com elevada pureza, estabilidade e atividade funcional utilizadas na produção de biofármacos. São necessários processos que ofereçam alta especificidade adaptabilidade e que sejam aplicáveis a uma vasta gama de biomoléculas ativas. A atividade funcional de uma proteína depende de sua estrutura tridimensional, a qual é imposta pelas suas interações com o ambiente envolvente. Os líquidos iónicos (LIs) e, mais recentemente, as misturas eutécticas, emergiram como plataformas valiosas para as aplicações biológicas onde é possível uma completa personalização dos materiais através da criteriosa seleção de aniões, catiões, dadores de pontes de hidrogénio. Assim, líquidos iónicos fluorados (LIFs) e misturas eutécticas inspiradas na natureza (formadas pela mistura de sais de colina ou carnitina com ácidos carboxílicos naturais de cadeia curta (ACCC), aprovados aditivos alimentares pela EFSA) foram usados para desenvolver sistemas aquosos bifásicos (SAB) seletivos para purificação de proteínas. Os sistemas de partição foram validados num crescente incremento de complexidade das biomoléculas estudadas. A partir de simples aminoácidos, como o triptofano (Trp), passando por proteínas de utilização convencional, como a lisozima e o soro bovino de albumina (BSA), e finalmente chegado a proteínas de elevado valor acrescentado e com relevância na indústria farmacêutica, como é o caso do Interferão-alpha 2b (IFN). No desenvolvimento de SAB mais seletivos e biocompatíveis foram tidas em conta duas direções complementares, garantindo a manutenção da atividade funcional das biomoléculas. Por um lado, o desenvolvimento de SAB compostos por sistemas eutécticos inspirados na natureza e por PPG400 (um polímero biocompatível amplamente usado em aplicações biofarmacêuticas) que respeita os parâmetros da química sustentável por si só e foram projetados para particionar seletivamente TRP para a fase alvo por formação de misturas euteticas (por adição de ACCC ao sistema composto por sais de colina e carnitina). Por outro lado, o desenvolvimento de os SAB baseados em LIF especificamente desenhados para desempenhar uma função e projetados para aumentar a seletividade num meio biocompatível para as proteínas. Considerando que a maioria das aplicações biológicas, incluindo etapas de purificação de proteínas, envolve soluções aquosas. É de grande relevância a conclusão inferida sobre estes líquidos iónicos de que limitam o impacto da adição de água na sua capacidade de aceitação de pontes de hidrogênio, um fator-chave no desenvolvimento de solventes funcionalizados para purificação de proteínas. Os LIFs permitem ainda a formação de ABS com solventes tipicamente utilizados como estabilizadores de proteínas, como açúcares. Por último, o SAB composto por LIF possibilitou a recuperação simultânea de IFN e albumina em fases opostas (usando a BSA como modelo; pois IFN e albumina estão presentes nos meios de cultura de células de mamíferos). Complementarmente, foram estudadas as interações entre as proteínas e os solutos de formação de SAB para entender o efeito do ambiente envolvente na estrutura, atividade e partição das proteínas estudadas. O SAB desenvolvido possibilita ainda uma produção mais eficiente, se substituídos os sistemas de macroescala em batch por operações em continuo (SAB em configurações de microfluídica). Foi alcançada a prova de conceito para a miniaturização de SAB compostos por LIs para a partição de TRP, verificando operações em batch de microtubos e operações de SAB microfluídicos. Os resultados desta tese demonstram a viabilidade do SAB desenvolvido para revolucionar os sistemas de purificação para proteínas terapêuticas, com grande impacto no setor dos biofármacos.
Descrição
Palavras-chave
Fluorinated Ionic Liquids Choline- and Carnitine-based Eutectics Selective Aqueous Biphasic Systems Tryptophan Lysozyme Albumin