Comparison of Therapeutic Delivery Efficacy of Different EV Subpopulations

Abstract

In the last decades, RNA therapeutics have been brought to light by the ability to silence or activate gene expression. However, RNA is degraded in bodily fluids and does not permeate the hydrophobic cell membranes, being necessary to use RNA carriers that can safely deliver it to the cells while maintaining its function. Extracellular vesicles (EVs) are secreted by the cells and recognized as natural information carriers within the body. They facilitate the RNA delivery between cells and hold the poten-tial for utilization as therapeutic delivery systems. EVs are highly heterogeneous, featuring various subpopulations formed in different biogenesis pathways. This heterogeneity of EVs results in different functions driven by the proteins present on their surface, enabling them to target different cell types and evoke different cellular responses. As such, it would be im-portant to compare the EV-mediated RNA delivery of the different subpopulations. Howev-er, the study of the different subpopulations is challenging, due to the lack of isolations methods for EV subpopulations based on their surface molecules. The aim of this work was to compare the efficiency of the EV-mediated RNA delivery of different EV subpopulations. HEK293T cells were engineered to express a recombinant pro-tein for loading of a sgRNA and Cas9 in the EVs for activation of the reporter system. The EV subpopulations were isolated in an immunoprecipitation with magnetic beads and add-ed to reporter cells of the reporter system. This system allowed the analysis of the EV-mediated RNA delivery by the expression of eGFP when the cells received the sgRNA and Cas9 loaded to the EVs. In all assays done CD9+ and CD81+ subpopulations were the most potent at delivering the cargo. Consequently, investigation of the subpopulations holds significant importance in advancing the development of therapeutic delivery systems.

Nas últimas décadas, têm vindo a ser desenvolvidas terapias de RNA devido à sua capaci-dade de ativar, silenciar ou editar genes. No entanto, o RNA é degradado nos fluidos corpo-rais e não permeia as membranas celulares hidrofóbicas, sendo necessário utilizar transpor-tadores que possam entregar o RNA às células, mantendo a sua função. As vesículas extracelulares (EVs) são segregadas pelas células e reconhecidas como transpor-tadores naturais de informação dentro do organismo, facilitando a entrega de RNA entre as células e com potencial para serem utilizadas como sistemas de vectroização terapêutica. As EVs são altamente heterogéneas, apresentando várias subpopulações formadas em diferen-tes vias de biogénese. Esta diversidade de EVs resulta em diferentes funções determinadas pelas proteínas presentes na sua superfície, permitindo-lhes visar diferentes tipos de células e evocar distintas respostas celulares. Como tal, é importante comparar a entrega de RNA mediada por EVs das diferentes subpopulações. No entanto, o estudo das diferentes subpo-pulações é difícil, uma vez que não existem métodos de isolamento das subpopulações de EV com base nas suas moléculas de superfície. O objetivo deste trabalho foi comparar a eficiência da entrega de RNA mediada por EVs de diferentes subpopulações. As células HEK293T foram concebidas para expressar uma prote-ína recombinante para carregar um sgRNA e Cas9 nos EVs para ativação do sistema repór-ter. As subpopulações de EVs foram isoladas numa imunoprecipitação com esferas magnéti-cas e adicionadas às células repórteres do sistema. Este sistema permitiu a análise da entrega de RNA mediada por EV através da expressão de eGFP quando as células receberam o sgR-NA e Cas9 carregados nos EVs. Em todos os ensaios efetuados, as subpopulações CD9+ e CD81+ foram as mais eficientes na entrega da carga. A continuada investigação das subpo-pulações tem uma importância significativa no avanço do desenvolvimento de sistemas de entrega terapêutica.