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Publicação
Functional Characterization and Design of Protein Nanocages
| Nome: | Descrição: | Tamanho: | Formato: | |
|---|---|---|---|---|
| 23.84 MB | Adobe PDF |
Autores
Orientador(es)
Resumo(s)
Compartmentalization is an essential cellular mechanism that allows cells to create and
organize controlled microenvironments for specific metabolic pathways, increase their
reaction rate and/or protect the cell from the harmful effect of substrates or products. Due to
the lack of organelles, prokaryotes produce protein-based compartments by protomer selfassembly.
Encapsulins, one of the bacterial nanocompartments most recently described, are
protein nanocages with the ability of sequestering other smaller proteins (cargo proteins)
within their cavity. The physiological function of encapsulins seems to be determined by the
type of cargo proteins encapsulated. Myxococcus xanthus encapsulin (EncA) is constituted by
180 protomers assembled into a 32 nm wide cage protein. This protein naturally encapsulates
two ferritin-like proteins (EncB and EncC) and a third protein with no predicted activity. The
encapsulation of cargo proteins and the characterization of the complex are described in this
thesis. No major structural changes in EncA were detected upon cargo encapsulation but the
assembly of EncC is shown to be iron-dependent. The function of the shell protein in
stabilizing and protecting cargo proteins from thermal denaturation is also demonstrated.
Additionally, a novel function of binding and protection of circular double stranded plasmid
DNA (pUC19) by EncA was discovered and characterized. Finally, the intrinsic ability of EncA
to mineralize iron was observed and described as similar to L-chain ferritins. The
encapsulation of EncC or EncB within EncA renders the complexes into a ferritin-like catalytic
active system. Differences in the chemical nature of the mineral core formed in the presence of
molecular oxygen and hydrogen peroxide were probed, as well as the detection of ferric
intermediates in EncC during the ferroxidation and iron mineralization reactions using
Mössbauer spectroscopy.
Dps, or DNA-binding protein from starved cells, is another bacterial
nanocompartment composed of 12 monomers assembled into a cube-like cage protein ~ 9 nm
wide. These proteins are known to bind and protect DNA and to accumulate ferric iron in their
cavity, protecting the cell from reactive oxygen species. However, the mechanism by which
labile iron returns to the cellular medium is still poorly understood. As such, the second part
of this thesis describes the iron release mechanism from the Dps of Marinobacter
hydrocarbonoclasticus while using WrbA, a flavoprotein, as an electron-transfer partner, NADH
as an electron donor and two types of iron acceptors: an inorganic compound (1,10-
phenanthroline) and a metalloprotein (rubredoxin). Although in aerobic conditions the iron is
only released when an iron chelator is present, labile iron is released into the solvent in
anaerobic condition. However, the presence of a chelator increases the rate of release.
Rubredoxin was proven to be suitable as a putative biological partner for the iron release from
Dps with faster iron release than in the presence of 1,10-phenanthroline.
A compartimentalização é um mecanismo celular essencial que permite que as células se organizem internamente e criem microambientes controlados permitindo vias metabólicas específicas, o aumento da taxa reacional e/ou a proteção celular dos efeitos nocivos de substratos ou produtos. Devido à ausência de organelos, os organismos procariontes produzem compartimentos através da produção e auto-organização de protómeros. As encapsulinas, um tipo de nanocompartimento proteico descoberto recentemente, são nanocages com capacidade de encapsular outras proteínas de menores dimensões (“proteínas-carga”) dentro da sua cavidade. A função biológica das encapsulinas ainda é relativamente desconhecida, mas parece estar associada à função das proteínas-carga encapsuladas. A encapsulina de Myxococcus xanthus (EncA) é composta por 180 monómeros organizados de modo a formar uma proteína esférica oca com 32 nm de diâmetro. Neste organismo, a EncA encapsula duas proteínas semelhantes a Ferritinas (EncB e EncC) e uma terceira sem atividade prevista. O trabalho nesta tese descreve o estudo deste sistema, a ausência de alterações estruturais notórias na EncA aquando do encapsulamento das proteínas-carga e a necessidade da presença de ferro para garantir a oligomerização completa da EncC. Observou-se, ainda, a função protetora da encapsulina das proteínas-carga durante a desnaturação térmica. Adicionalmente, foi descoberta como nova função da EncA a capacidade de se ligar e proteger DNA plasmídico circular (pUC19). Finalmente, demonstrouse a atividade da EncA em realizar a mineralização de ferro de forma semelhante às ferritinas do tipo L e que a encapsulação das proteínas-carga EncB e EncC converte o complexo num sistema catalítico. As diferenças na natureza do mineral férrico quando este se forma na presença de oxigénio molecular ou de peróxido de hidrogénio e a deteção de intermediários férricos durante a reação de ferroxidação pela EncC foram analisadas através da espectroscopia de Mössbauer. A Dps, DNA-binding protein from starved cells, é outro nanocompartimento bacteriano composto por 12 monómeros que formam uma proteína oca, quase cúbica, com 9 nm de largura. Sabe-se que essas proteínas se ligam ao DNA bacteriano, protegendo-o, e armazenam ferro na sua cavidade protegendo o organismo de danos por espécies reativas de oxigénio. No entanto, o mecanismo pelo qual o ferro é libertado para o meio celular de forma biodisponível é um fenómeno pouco estudado. Assim, na segunda parte desta tese é descrito o mecanismo de libertação de ferro da Dps de Marinobacter hydrocarbonoclasticus, acoplando a reação à ação da flavo-proteína WrbA como parceira de transferência eletrónica, NADH como doador de eletrões e dois tipos de aceitadores de ferro: um composto inorgânico (1,10-fenantrolina) e uma metaloproteína (rubredoxina). Apesar de em condições aeróbicas o ferro apenas ser libertado na presença de um quelante, este é libertado para a solução em condições anaeróbicas. Contudo, a presença do quelante aumenta a taxa de libertação. A rubredoxina mostrou ser um bom candidato como parceiro biológico para a libertação de ferro sendo que sua presença aumenta a taxa de libertação de ferro comparativamente à molécula inorgânica.
A compartimentalização é um mecanismo celular essencial que permite que as células se organizem internamente e criem microambientes controlados permitindo vias metabólicas específicas, o aumento da taxa reacional e/ou a proteção celular dos efeitos nocivos de substratos ou produtos. Devido à ausência de organelos, os organismos procariontes produzem compartimentos através da produção e auto-organização de protómeros. As encapsulinas, um tipo de nanocompartimento proteico descoberto recentemente, são nanocages com capacidade de encapsular outras proteínas de menores dimensões (“proteínas-carga”) dentro da sua cavidade. A função biológica das encapsulinas ainda é relativamente desconhecida, mas parece estar associada à função das proteínas-carga encapsuladas. A encapsulina de Myxococcus xanthus (EncA) é composta por 180 monómeros organizados de modo a formar uma proteína esférica oca com 32 nm de diâmetro. Neste organismo, a EncA encapsula duas proteínas semelhantes a Ferritinas (EncB e EncC) e uma terceira sem atividade prevista. O trabalho nesta tese descreve o estudo deste sistema, a ausência de alterações estruturais notórias na EncA aquando do encapsulamento das proteínas-carga e a necessidade da presença de ferro para garantir a oligomerização completa da EncC. Observou-se, ainda, a função protetora da encapsulina das proteínas-carga durante a desnaturação térmica. Adicionalmente, foi descoberta como nova função da EncA a capacidade de se ligar e proteger DNA plasmídico circular (pUC19). Finalmente, demonstrouse a atividade da EncA em realizar a mineralização de ferro de forma semelhante às ferritinas do tipo L e que a encapsulação das proteínas-carga EncB e EncC converte o complexo num sistema catalítico. As diferenças na natureza do mineral férrico quando este se forma na presença de oxigénio molecular ou de peróxido de hidrogénio e a deteção de intermediários férricos durante a reação de ferroxidação pela EncC foram analisadas através da espectroscopia de Mössbauer. A Dps, DNA-binding protein from starved cells, é outro nanocompartimento bacteriano composto por 12 monómeros que formam uma proteína oca, quase cúbica, com 9 nm de largura. Sabe-se que essas proteínas se ligam ao DNA bacteriano, protegendo-o, e armazenam ferro na sua cavidade protegendo o organismo de danos por espécies reativas de oxigénio. No entanto, o mecanismo pelo qual o ferro é libertado para o meio celular de forma biodisponível é um fenómeno pouco estudado. Assim, na segunda parte desta tese é descrito o mecanismo de libertação de ferro da Dps de Marinobacter hydrocarbonoclasticus, acoplando a reação à ação da flavo-proteína WrbA como parceira de transferência eletrónica, NADH como doador de eletrões e dois tipos de aceitadores de ferro: um composto inorgânico (1,10-fenantrolina) e uma metaloproteína (rubredoxina). Apesar de em condições aeróbicas o ferro apenas ser libertado na presença de um quelante, este é libertado para a solução em condições anaeróbicas. Contudo, a presença do quelante aumenta a taxa de libertação. A rubredoxina mostrou ser um bom candidato como parceiro biológico para a libertação de ferro sendo que sua presença aumenta a taxa de libertação de ferro comparativamente à molécula inorgânica.
Descrição
Palavras-chave
Encapsulin Cargo protein Ferritin-like protein DNA-binding protein from starved cells (Dps) Iron homeostasis Structural dynamics