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Publicação
Unravelling the reaction mechanism of glutamate amidation in Staphylococcus aureus peptidoglycan
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Orientador(es)
Resumo(s)
MurT-GatD is the bi-enzymatic complex responsible for catalysing the amidation of peptidoglycan in Gram-positive bacteria, ensuring the correct assembly of their cell wall. MurT-GatD is essential in antibiotic resistant human pathogens such as Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae and Mycobacterium tuberculosis, and therefore, constitutes a promising target for the development of new antimicrobial agents. Peptidoglycan amidation is achieved through the glutamine amidotransferase activity of the MurT-GatD complex, requiring the presence of glutamine, ATP and magnesium. The main goal of this thesis is to unravel the reaction mechanism of peptidoglycan amidation through an integrative approach that combines structural methods with functional assays, in order to characterize the structure-function relationship of the S. aureus MurT-GatD complex.
The crystal structure of isolated S. aureus GatD was solved at 1.9 Å of resolution (PDB 5N9M) and provided the first structural insights into the MurT-GatD complex. GatD adopts the overall fold of glutaminase proteins and shows the nucleophilic cysteine and the polarizing histidine commonly associated with glutamine hydrolysis. 1H-NMR experiments showed that GatD C94A or H189A abolished the glutaminase activity of the complex. Similarly, GatD R128 also proved to be an essential residue for catalysis, likely by capturing glutamine to the active site.
The crystal structure of S. aureus MurT-GatD was solved at 2.9 Å of resolution (PDB 7Q8E), showing a heterodimer in an extended conformation. GatD adopts the same glutaminase-like fold as in its isolated form, while MurT displays two distinct domains: the central domain containing, a cysteine-rich insertion and the ATP binding site, and the C-terminal domain that interacts with GatD. The overall structure of S. aureus MurT-GatD is very different from S. pneumoniae MurT-GatD, which adopts a compact conformation. The two complexes also adopt different conformations in solution, as observed through Small-Angle X-ray Scattering (SAXS) studies, and showed different in vitro enzymatic activities, suggesting that the extended conformation of S. aureus MurT-GatD is catalytically less competent.
The structural data of MurT-GatD from S. aureus and S. pneumoniae were combined to identify the molecular determinants involved in the glutaminase and amidotransferase active sites of the complex, as well as, in protein-protein interactions. The work carried out in this thesis contributed to the clarification of the reaction mechanism of peptidoglycan amidation, which can be explored for the development of new drugs with antimicrobial activity.
MurT-GatD é o complexo bi-enzimático que catalisa a amidação do peptidoglicano em bactérias Gram-positivas, garantindo a correta organização da sua parece celular. MurT-GatD é essencial em bactérias resistentes a antibióticos que são patogénicas a humanos, como Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae e Mycobacterium tuberculosis, e, consequentemente constitui um alvo promissor a ter em conta no desenvolvimento de novos agentes antimicrobianos. A amidação do peptidoglicano é realizada pela actividade de glutamina amidotransferase do complexo MurT-GatD, requerendo a presença de glutamina, ATP e magnésio. O principal objectivo desta tese é revelar o mecanismo reaccional da amidação do peptidoglicano através de uma abordagem integrativa que combina métodos estruturais com ensaios funcionais, de modo a caracterizar a relação estrutura-função do complexo MurT-GatD de S. aureus. A estrutura cristalina da proteína GatD de S. aureus foi resolvida a 1.9 Å de resolução (PDB 5N9M) e forneceu as primeiras evidências estruturais sobre o complexo MurT-GatD. GatD adopta uma organização 3D semelhante a glutaminases, apresentando uma cisteína nucleofílica e uma histidina polarizadora comummente associadas à hidrólise de glutamina. Experiências de 1H-NMR mostraram que os mutantes C94A ou H189A da GatD aboliram a actividade de glutaminase do complexo. De forma similar, R128 da GatD também provou ser um resíduo essencial na catálise, provavelmente por capturar glutamina para o centro activo. A estrutura cristalina do complexo MurT-GatD de S. aureus foi resolvida a 2.9 Å de resolução (PDB 7Q8E), mostrando um heterodímero numa conformação estendida. A GatD adopta a mesma organização estrutural característica de glutaminases, enquanto a MurT apresenta dois domínios distintos: o domínio central que contém uma inserção rica em cisteínas e o local de ligação ao ATP, e o domínio C-terminal que interage com a GatD. A estrutura global do complexo MurT-GatD de S. aureus é muito diferente do complexo MurT-GatD de S. pneumoniae, tendo em conta que este adopta uma conformação compacta. Os dois complexos também adoptam diferentes conformações em solução, como observado através de estudos de Dispersão de raios X a Baixo Ângulo (SAXS), tendo demonstrado diferentes actividades enzimática in vitro, sugerindo que a conformação estendida de MurT-GatD de S. aureus é cataliticamente menos competente. Os dados estruturais sobre o complexo MurT-GatD de S. aureus e S. pneumoniae foram combinados para identificar os determinantes moleculares envolvidos nos centros activos de glutaminase e de amidotransferase do complexo, assim como, nas interacções proteína-proteína. O trabalho desta tese teve uma importante contribuição para a elucidação do mecanismo reaccional da amidação do peptidoglicano, o que pode vir a ser explorado no desenvolvimento de novos fármacos com actividade antimicrobiana.
MurT-GatD é o complexo bi-enzimático que catalisa a amidação do peptidoglicano em bactérias Gram-positivas, garantindo a correta organização da sua parece celular. MurT-GatD é essencial em bactérias resistentes a antibióticos que são patogénicas a humanos, como Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae e Mycobacterium tuberculosis, e, consequentemente constitui um alvo promissor a ter em conta no desenvolvimento de novos agentes antimicrobianos. A amidação do peptidoglicano é realizada pela actividade de glutamina amidotransferase do complexo MurT-GatD, requerendo a presença de glutamina, ATP e magnésio. O principal objectivo desta tese é revelar o mecanismo reaccional da amidação do peptidoglicano através de uma abordagem integrativa que combina métodos estruturais com ensaios funcionais, de modo a caracterizar a relação estrutura-função do complexo MurT-GatD de S. aureus. A estrutura cristalina da proteína GatD de S. aureus foi resolvida a 1.9 Å de resolução (PDB 5N9M) e forneceu as primeiras evidências estruturais sobre o complexo MurT-GatD. GatD adopta uma organização 3D semelhante a glutaminases, apresentando uma cisteína nucleofílica e uma histidina polarizadora comummente associadas à hidrólise de glutamina. Experiências de 1H-NMR mostraram que os mutantes C94A ou H189A da GatD aboliram a actividade de glutaminase do complexo. De forma similar, R128 da GatD também provou ser um resíduo essencial na catálise, provavelmente por capturar glutamina para o centro activo. A estrutura cristalina do complexo MurT-GatD de S. aureus foi resolvida a 2.9 Å de resolução (PDB 7Q8E), mostrando um heterodímero numa conformação estendida. A GatD adopta a mesma organização estrutural característica de glutaminases, enquanto a MurT apresenta dois domínios distintos: o domínio central que contém uma inserção rica em cisteínas e o local de ligação ao ATP, e o domínio C-terminal que interage com a GatD. A estrutura global do complexo MurT-GatD de S. aureus é muito diferente do complexo MurT-GatD de S. pneumoniae, tendo em conta que este adopta uma conformação compacta. Os dois complexos também adoptam diferentes conformações em solução, como observado através de estudos de Dispersão de raios X a Baixo Ângulo (SAXS), tendo demonstrado diferentes actividades enzimática in vitro, sugerindo que a conformação estendida de MurT-GatD de S. aureus é cataliticamente menos competente. Os dados estruturais sobre o complexo MurT-GatD de S. aureus e S. pneumoniae foram combinados para identificar os determinantes moleculares envolvidos nos centros activos de glutaminase e de amidotransferase do complexo, assim como, nas interacções proteína-proteína. O trabalho desta tese teve uma importante contribuição para a elucidação do mecanismo reaccional da amidação do peptidoglicano, o que pode vir a ser explorado no desenvolvimento de novos fármacos com actividade antimicrobiana.
Descrição
Palavras-chave
MurT-GatD Peptidoglycan amidation Staphylococcus aureus X-ray crystallography Streptococcus pneumoniae