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Publicação
Biophysical and Biochemical Characterization of Proteins involved in Transition Metals Homeostasis
| Nome: | Descrição: | Tamanho: | Formato: | |
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Autores
Orientador(es)
Resumo(s)
Cellular homeostasis depends on the coordinated activity of a vast array of proteins,
including membrane transporters, metabolic enzymes or storage and protection proteins. The
latter include the proteins from the Ferritin family of proteins, essential to the intracellular
oxidative stress response, shielding the cell from harmful reactive oxygen species.
DNA-binding proteins from starved cells (Dps), also termed miniferritins, protect
bacterial DNA through two concomitant activities: indirect protection via ferroxidation and
mineralization of up to 500 iron atoms and direct shielding through DNA binding and
condensation. Their DNA-binding properties are related with their N-terminal tail extensions,
of striking evolutionary diversity in length and composition. Given their importance to protein
function, several questions remain unanswered regarding their conformational dynamics and
functional features.
The human mitochondrial ferritin (FtMt) was recently discovered as the mitochondrial
counterpart to cytosolic ferritins. FtMt expression protects mitochondria (and the cell) from
acute oxidative stress damage by regulating the levels of toxic labile iron. FtMt has been
associated with several diseases related with iron and acute oxidative stress, but a deeper
understanding of its biochemical and biophysical properties is still a relevant research goal.
The work presented in this Thesis focused on probing the structural and functional
properties of the Dps from the bacterium Deinoccocus grandis (DgrDps) and the human FtMt.
The results from the DgrDps project reveal that the N-terminal tails of DgrDps may exist
in different conformations, here investigated using Small Angle X-ray Scattering (SAXS),
Dynamic Light Scattering (DLS) and Size-Exclusion Chromatography (SEC). Also, the position
of tails can be modulated in vitro by external factors such as the ionic strength or the addition
of specific transition metals. A novel iron-binding site was discovered and localized in the Nterminal
tails using Mössbauer spectroscopy. The occupation of this binding site induces a
conformational change in the tails, altering the structural properties of the protein.
Regarding FtMt, it is shown that although the apo-form of FtMt is highly resistant, the
accommodation of the iron mineral core leads to a decrease in the thermal stability of the
protein and a particle aggregation effect correlated with the size of the iron core.
O funcionamento e sobrevivência das células são garantidos pela ação concertada de um vasto número de proteínas, incluindo transportadores de membrana, enzimas metabólicas ou proteínas de transporte e armazenamento. A família das Ferritinas exerce um papel essencial na homeostasia do ferro e proteção contra a toxicidade das espécies reativas de oxigénio. As DNA-binding proteins from starved cells (Dps), também conhecidas como miniferritinas, protegem o DNA procarionte através de duas funções: proteção indireta pela ferroxidação e mineralização de até 500 átomos de ferro e, também de forma direta, pela ligação e condensação do DNA. A ligação ao DNA é feita através das extensões N-terminais, de tamanho e composição variáveis. Dada a sua importância, o foco de muita da investigação em Dps está na dinâmica conformacional e função destas extensões. A ferritina mitocondrial (FtMt) humana foi identificada recentemente como a versão mitocondrial das ferritinas citosólicas. A expressão desta proteína protege as mitocôndrias (e a célula) do stress oxidativo. Embora a FtMt já tenha sido associada a várias patologias relacionadas com o ferro e stress oxidativo, restam ainda algumas questões relevantes acerca das suas propriedades bioquímicas e biofísicas. O trabalho desta Tese tem como objetivo a caracterização estrutural e funcional da Dps da bactéria Deinococcus grandis (DgrDps) e da ferritina mitocondrial humana (hFtMt). Os resultados do projeto da DgrDps revelaram que as extensões N-terminais podem adotar diferentes conformações, investigadas neste trabalho através de Dispersão de Raios-X a Baixo Ângulo (SAXS), Dispersão Dinâmica de Luz (DLS) e Cromatografia de Exclusão Molecular (SEC). A posição destas extensões pode ser controlada in vitro por fatores externos como a força iónica do meio ou a adição de metais de transição específicos. Um novo centro de coordenação de ferro foi identificado na região N-terminal através de espectroscopia de Mössbauer. A ocupação deste local de ligação por certos metais induz uma alteração conformacional das extensões, alterando as propriedades estruturais da proteína. Demonstrou-se, ainda, que embora a hFtMt seja significativamente resistente à desnaturação térmica e química, a presença de mineral férrico no seu interior leva à desestabilização da sua estrutura. À medida que o tamanho do core mineral aumenta, a proteína torna-se progressivamente mais sensível à desnaturação térmica e à agregação interproteína.
O funcionamento e sobrevivência das células são garantidos pela ação concertada de um vasto número de proteínas, incluindo transportadores de membrana, enzimas metabólicas ou proteínas de transporte e armazenamento. A família das Ferritinas exerce um papel essencial na homeostasia do ferro e proteção contra a toxicidade das espécies reativas de oxigénio. As DNA-binding proteins from starved cells (Dps), também conhecidas como miniferritinas, protegem o DNA procarionte através de duas funções: proteção indireta pela ferroxidação e mineralização de até 500 átomos de ferro e, também de forma direta, pela ligação e condensação do DNA. A ligação ao DNA é feita através das extensões N-terminais, de tamanho e composição variáveis. Dada a sua importância, o foco de muita da investigação em Dps está na dinâmica conformacional e função destas extensões. A ferritina mitocondrial (FtMt) humana foi identificada recentemente como a versão mitocondrial das ferritinas citosólicas. A expressão desta proteína protege as mitocôndrias (e a célula) do stress oxidativo. Embora a FtMt já tenha sido associada a várias patologias relacionadas com o ferro e stress oxidativo, restam ainda algumas questões relevantes acerca das suas propriedades bioquímicas e biofísicas. O trabalho desta Tese tem como objetivo a caracterização estrutural e funcional da Dps da bactéria Deinococcus grandis (DgrDps) e da ferritina mitocondrial humana (hFtMt). Os resultados do projeto da DgrDps revelaram que as extensões N-terminais podem adotar diferentes conformações, investigadas neste trabalho através de Dispersão de Raios-X a Baixo Ângulo (SAXS), Dispersão Dinâmica de Luz (DLS) e Cromatografia de Exclusão Molecular (SEC). A posição destas extensões pode ser controlada in vitro por fatores externos como a força iónica do meio ou a adição de metais de transição específicos. Um novo centro de coordenação de ferro foi identificado na região N-terminal através de espectroscopia de Mössbauer. A ocupação deste local de ligação por certos metais induz uma alteração conformacional das extensões, alterando as propriedades estruturais da proteína. Demonstrou-se, ainda, que embora a hFtMt seja significativamente resistente à desnaturação térmica e química, a presença de mineral férrico no seu interior leva à desestabilização da sua estrutura. À medida que o tamanho do core mineral aumenta, a proteína torna-se progressivamente mais sensível à desnaturação térmica e à agregação interproteína.
Descrição
Palavras-chave
DNA-binding protein from starved cells (Dps) Conformational dynamics of proteins; Mitochondrial Ferritin (FtMt) Synchrotron Radiation Circular Dichroism Small Angle X-ray Scattering Mössbauer spectroscopy