Dissecting neuronal dysfunction and microglia/motoneurons cross-talk in ALS: an immunofluorescence directed study

Abstract

A esclerose Lateral Amiotrófica (ELA) é uma doença neurodegenerativa fatal, afectando de 0.4 a 1.8/100,000 habitantes. Caracteriza-se pela degeneração dos neurónios motores (NM), mas também afeta a microglia. Contudo, a contribuição desta célula na doença não está esclarecida. Pretendeu-se: (i) explorar os processos de disfunção dos NM na ELA, nomeadamente a dinâmica mitocondrial (fusão/fissão) e transporte axonal (anterógrado/retrógrado), assim como mecanismos de morte celular; (ii) avaliar a contribuição da microglia pelo uso de culturas mistas de NM-microglia; iii) implementar o modelo de culturas organotípicas de medula espinhal (ME) de ratinhos transgénicos para ELA, para avaliar efeitos neuroprotectores pelo ácido glico-ursodeoxicólico (AGUDC). Utilizaram-se: (i) células NSC-34, uma linha celular de NM, transfectada com superóxido dismutase humana (hSOD1) normal (WT) ou com mutação G93A; (ii) células N9, uma linha celular microglial, em cultura mista com NSC-34 (hSOD1WT ou hSOD1G93A); (iii) culturas organotípicas de segmentos lombares de ME de murganhos com 7 dias (SJL-wt) ou transgénicos, contendo a SOD1 humana mutada (TgSOD1-G93A), incubados ou não com AGUDC aos 10 dias-in-vitro (DIV). Utilizaram-se técnicas de imunocitoquímica, citometria de fluxo e ensaio fluorimétrico/colorimétrico para o ATP e óxido nítrico (NO), respectivamente. A viabilidade das células NSC-34/hSOD1G93A e da marcação para a βIII-tubulina diminuiu com a diferenciação. A apoptose (estádios iniciais) e a libertação de NO (P<0.01) e ATP (P<0.05) aumentou. Verificou-se disfunção da dinâmica mitocondrial por maior fissão (P<0.05) e menor fusão(P<0.01), diminuindo o transporte axonal retrógrado aos 7 DIV (P<0.01). Nas culturas mistas, a microglia aumentou a produção de NO e diminuiu a de ATP (P<0.05). As culturas organotípicas de ME foram implementadas e os ensaios com AGUDC sugerem recuperação da viabilidade celular sem alteração nos níveis de NO e ATP. Uma melhor compreensão da falência celular na ELA e da eficácia do AGUDC podem abrir novas possibilidades terapêuticas para a doença.