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Biochemical and functional characterization of molecular systems from Neisseria gonorrhoeae and Staphylococcus aureus important for the infection process
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Host-pathogens interactions are crucial for the progression and outcomes of infectious diseases. To impair pathogen proliferation, the host employs various defensive mechanisms, including oxidative stress and metal toxicity. Moreover, inherent conditions of the infection sites, such as O2-limited environments, can also prevent pathogen colonization. As a result, pathogens have developed adaptive strategies to mitigate host-induced stresses and thrive within the host environment.
Neisseria gonorrhoeae has developed multiple strategies to successfully proliferate within the human host and detoxify reactive oxygen species. One of these includes the periplasmic bacterial peroxidase (NgBCCP), that reduces H2O2 to water and the truncated denitrification pathway comprised by a copper nitrite reductase (NgCuNiR), which reduces NO2- to NO, and a quinol-dependent nitric oxide reductase that reduces NO to N2O. Given that NgBCCP and NgCuNiR are oxidoreductases, an electron transfer system is required for their activity, and NgCytc2 was shown to fulfil this function in vitro. The recombinant NgCytc2 is a 17.4 kDa monohemic His-Met c-type cytochrome. Circular dichroism (CD) showed that NgCytc2 has a mixed secondary structure with both α-helix and β-sheet elements and that the propionates of its heme are antiparallel. The lower reduction potential of its heme group (+ 181 mV ± 5, pH 7.0) is explained by higher level of solvent exposure of the heme compared to other class I c-type cytochromes, supported by analysis of its structural model. Mediated catalysis of NgBCCP by NgCytc2 examined by electrochemical techniques demonstrated its role as putative physiological electron donor to this enzyme. The recombinant soluble domain of NgCuNiR is a 96 kDa homotrimeric protein with one T1Cu and one T2Cu copper centres per subunit. Its visible spectrum classifies it as a bluish-green CuNiR, with EPR showing that its T1Cu centre exhibits a rhombic signal typical of bluish-green cupredoxins, while the nature of T2Cu centre signal aligns with those of other CuNiRs. CD and DSC revealed that NgCuNiR is highly thermostable (Tm of 94 °C), with the T1Cu centre still present at 80 °C. Steady state-kinetics with different artificial electron donors confirms that NgCuNiR was catalytically active and the estimated K_M ∼ 4.0 µM at pH 6.0 is the lowest value reported thus far. Mediated catalysis of NgCuNiR by NgCytc2 showed, for the first time, a direct interaction between these proteins, supporting its potential role as a physiological electron donor to this enzyme.
Copper plays a key role in host immune defence, as macrophages resort to copper to induce cellular stress on invading pathogens, in addition given the limited efficiency of conventional antibiotics against methicillin-resistance Staphylococcus aureus (MRSA), alternative antimicrobial strategies have been used, such as copper and copper compounds. Copper redox activity allows the production of reactive species, able to damage essential biomolecules and consequently hamper metabolic pathways. However, S. aureus has mechanisms to maintain copper homeostasis and mitigate its toxicity within the cell. The impact of copper on the formation and composition of biofilms, the structure of the peptidoglycan and the production of wall teichoic acids (WTAs) in four strains with different backgrounds of copper resistance showed a highly strain-dependent response to copper sulfate. The proficient biofilm-producing strain (S. aureus ATCC 25923) exhibited impaired biofilm formation in the presence of copper sulfate. In contrast, the lower/weak biofilm-producing strains (S. aureus NRS105, ST398 and COL) showed increased biofilm mass under these conditions. Furthermore, exposure to copper increased the production of WTAs among all strains, although the strain with compromised biofilm production exhibited lower molecular mass or differently modified WTAs. Since WTAs are essential for biofilm formation in S. aureus, the inability of S. aureus ATCC 25923 to produce biofilms under copper stress is probably related to the observed structural changes in WTAs. Additionally, all strains showed similar peptidoglycan composition regardless of copper exposure, with the peptidoglycan of the copper treated cells exhibiting higher degree of cross-linking possibly due to copper mismetalation reducing the activity of the zinc-dependent hydrolase AltA. While no direct correlation can be drawn between the copper resistance background of each strain and the observed phenotypes, S. aureus ATCC 25923 showed lower growth inhibition in the presence of copper sulfate during static growth.
As interações entre hospedeiro e agente patogénico desempenham um papel crucial na progressão e resolução de doenças infeciosas. De modo a evitar a proliferação microbiana, o hospedeiro recorre a diversos mecanismos de defesa, como indução de stress oxidativo e toxicidade associada a metais pesados. Para além disso, condições inerentes aos locais de infeção, como baixos níveis de O2, contribuem para limitar o crescimento microbiano. Face a estes desafios, os agentes patogénicos desenvolveram mecanismos para resistir às defesas do hospedeiro e prosperar no local de infeção. Neisseria gonorrhoeae é o agente patogénico humano responsável pela doença sexualmente transmissível gonorreia. N. gonorrhoeae desenvolveu vários mecanismos para mitigar os stresses induzidos pelo hospedeiro, incluindo a peroxidase bacteriana (NgBCCP), que reduz H2O2 a água, a via truncada de desnitrificação, composta pela redutase de nitrito de cobre (NgCuNiR), que reduz NO2- a NO, e a redutase de oxido nítrico dependente de quinol (NgNOR), que reduz NO a N2O. Enquanto a NgBCCP contribui para a proteção contra stress peroxidativo, a via truncada de desnitrificação reduz stress por espécies reativas de azoto, promove a proliferação bacteriana em ambientes com baixos níveis de O2, modula a resposta inflamatória do hospedeiro (regulando os níveis de NO) e inibe o processo de esfoliação das células do hospedeiro. Dado que a NgBCCP e a NgCuNiR catalisam reações redox, a sua atividade depende da presença de um sistema de transferência de eletrões, tendo sido proposto que esta função seja desempenhada por um pequeno citocromo do tipo-c periplasmático (NgCytc2). O NgCytc2 recombinante é um citocromo do tipo-c pertencente à classe I, monohémico e com uma massa molecular de 17.4 kDa. O ferro do grupo hemo é hexacoordenado (His-Met) e encontra-se num estado de spin-baixo à temperatura ambiente e pH fisiológico. Através de dicroísmo circular (CD) observou-se que o NgCytc2 apresenta uma estrutura secundária composta por hélices-α e folhas-β, estando os grupos propionatos do grupo hemo orientados de modo antiparalelo. O baixo potencial de redução do seu grupo hemo (+ 181 ± 1 mV, pH 7.0) é atribuído a um nível de exposição mais elevado dos propionatos ao solvente em comparação com outros citocromos do tipo-c da classe I. A catalise mediada da NgBCCP pelo NgCytc2, estudada por voltametria cíclica, demostrou que o NgCytc2 poderá atuar como dador de eletrões fisiológico desta enzima. O domínio solúvel recombinante da NgCuNiR apresenta uma massa molecular de 96 kDa e consiste num homotrímero, sendo que cada monómero possui um centro de cobre T1Cu e um T2Cu. O espetro de UV-visível classifica esta enzima como membro da classe de CuNiRs azul-esverdeadas, com o espetro de EPR a demonstrar que o centro T1Cu apresenta um sinal rômbico, típico de pequenas cupredoxinas azul-esverdeadas, enquanto o sinal do centro T2Cu é semelhante ao observado em outras CuNiRs. Estudos de termoestabilidade por CD e DSC mostraram que a NgCuNiR é extremamente termoestável (Tm de 94 °C), com o centro T1Cu ainda presente a 90 °C. Estudos cinéticos em estado estacionário, utilizando dadores de eletrões artificiais, confirmaram que a NgCuNiR está cataliticamente ativa, apresentando um K_M ∼ 4.0 µM estimado a pH 6.0, o valor mais baixo até agora reportado para CuNiRs. Ensaios de atividade com o NgCytc2 revelaram, pela primeira vez, uma interação direta entre as duas proteínas que permite a redução de nitrito pela NgCuNiR, apoiando o seu potencial papel como seu dador de eletrões fisiológico. O cobre desempenha um papel crucial na defesa imunitária do hospedeiro, uma vez que os macrófagos mobilizam este metal para induzir stress celular em agentes patogénicos. Adicionalmente, considerando a baixa eficácia dos antibióticos convencionais contra Staphyloccocus aureus resistente à meticilina, estratégias antimicrobianas alternativas, como cobre e compostos derivados de cobre, têm sido desenvolvidas. No entanto, S. aureus apresenta mecanismos para manter a homeostase do cobre e mitigar a toxicidade deste metal dentro da célula. O estudo do impacto do cobre na formação e composição de biofilme, na estrutura do peptidoglicano e na produção de ácidos teicóicos da parede (WTAs) em quatro estirpes com diferentes mecanismos de resistência ao cobre revelou que resposta ao sulfato de cobre varia consoante a estirpe. A capacidade de formação de biofilme pela estirpe produtora de biofilme (S. aureus ATCC 25923) é comprometida na presença de cobre. Em contraste, estirpes com baixa capacidade de formação de biofilme (S. aureus NRS105, ST398 e COL) apresentam uma maior formação de biofilme na presença de cobre. Adicionalmente, exposição ao sulfato de cobre induziu um aumento na produção de WTAs em todas as estirpes, embora a estirpe com a capacidade de formação de biofilme comprometida (S. aureus ATCC 25923) apresente WTAs com uma modificação diferente. Dado que os ácidos teicóicos são essenciais para a formação de biofilme em S. aureus, a incapacidade desta estirpe de formar biofilme sob stress por cobre poderá estar associada às alterações estruturais detetadas nos mesmos. Além disso, todas as estirpes apresentaram uma composição de peptidoglicano semelhante, independentemente da exposição ao cobre, sendo que os peptidoglicanos de células expostas ao cobre apresentam um maior nível de oligomerização. Isto poderá dever-se à possível ligação do cobre ao centro catalítico da hidrólase AtlA dependente de zinco, reduzindo a sua atividade. Apesar de não ser possível estabelecer uma correlação direta entre o perfil genético de resistência ao cobre e os fenótipos observados, S. aureus ATCC 25923 demonstrou menor inibição do crescimento em condições estáticas na presença de cobre.
As interações entre hospedeiro e agente patogénico desempenham um papel crucial na progressão e resolução de doenças infeciosas. De modo a evitar a proliferação microbiana, o hospedeiro recorre a diversos mecanismos de defesa, como indução de stress oxidativo e toxicidade associada a metais pesados. Para além disso, condições inerentes aos locais de infeção, como baixos níveis de O2, contribuem para limitar o crescimento microbiano. Face a estes desafios, os agentes patogénicos desenvolveram mecanismos para resistir às defesas do hospedeiro e prosperar no local de infeção. Neisseria gonorrhoeae é o agente patogénico humano responsável pela doença sexualmente transmissível gonorreia. N. gonorrhoeae desenvolveu vários mecanismos para mitigar os stresses induzidos pelo hospedeiro, incluindo a peroxidase bacteriana (NgBCCP), que reduz H2O2 a água, a via truncada de desnitrificação, composta pela redutase de nitrito de cobre (NgCuNiR), que reduz NO2- a NO, e a redutase de oxido nítrico dependente de quinol (NgNOR), que reduz NO a N2O. Enquanto a NgBCCP contribui para a proteção contra stress peroxidativo, a via truncada de desnitrificação reduz stress por espécies reativas de azoto, promove a proliferação bacteriana em ambientes com baixos níveis de O2, modula a resposta inflamatória do hospedeiro (regulando os níveis de NO) e inibe o processo de esfoliação das células do hospedeiro. Dado que a NgBCCP e a NgCuNiR catalisam reações redox, a sua atividade depende da presença de um sistema de transferência de eletrões, tendo sido proposto que esta função seja desempenhada por um pequeno citocromo do tipo-c periplasmático (NgCytc2). O NgCytc2 recombinante é um citocromo do tipo-c pertencente à classe I, monohémico e com uma massa molecular de 17.4 kDa. O ferro do grupo hemo é hexacoordenado (His-Met) e encontra-se num estado de spin-baixo à temperatura ambiente e pH fisiológico. Através de dicroísmo circular (CD) observou-se que o NgCytc2 apresenta uma estrutura secundária composta por hélices-α e folhas-β, estando os grupos propionatos do grupo hemo orientados de modo antiparalelo. O baixo potencial de redução do seu grupo hemo (+ 181 ± 1 mV, pH 7.0) é atribuído a um nível de exposição mais elevado dos propionatos ao solvente em comparação com outros citocromos do tipo-c da classe I. A catalise mediada da NgBCCP pelo NgCytc2, estudada por voltametria cíclica, demostrou que o NgCytc2 poderá atuar como dador de eletrões fisiológico desta enzima. O domínio solúvel recombinante da NgCuNiR apresenta uma massa molecular de 96 kDa e consiste num homotrímero, sendo que cada monómero possui um centro de cobre T1Cu e um T2Cu. O espetro de UV-visível classifica esta enzima como membro da classe de CuNiRs azul-esverdeadas, com o espetro de EPR a demonstrar que o centro T1Cu apresenta um sinal rômbico, típico de pequenas cupredoxinas azul-esverdeadas, enquanto o sinal do centro T2Cu é semelhante ao observado em outras CuNiRs. Estudos de termoestabilidade por CD e DSC mostraram que a NgCuNiR é extremamente termoestável (Tm de 94 °C), com o centro T1Cu ainda presente a 90 °C. Estudos cinéticos em estado estacionário, utilizando dadores de eletrões artificiais, confirmaram que a NgCuNiR está cataliticamente ativa, apresentando um K_M ∼ 4.0 µM estimado a pH 6.0, o valor mais baixo até agora reportado para CuNiRs. Ensaios de atividade com o NgCytc2 revelaram, pela primeira vez, uma interação direta entre as duas proteínas que permite a redução de nitrito pela NgCuNiR, apoiando o seu potencial papel como seu dador de eletrões fisiológico. O cobre desempenha um papel crucial na defesa imunitária do hospedeiro, uma vez que os macrófagos mobilizam este metal para induzir stress celular em agentes patogénicos. Adicionalmente, considerando a baixa eficácia dos antibióticos convencionais contra Staphyloccocus aureus resistente à meticilina, estratégias antimicrobianas alternativas, como cobre e compostos derivados de cobre, têm sido desenvolvidas. No entanto, S. aureus apresenta mecanismos para manter a homeostase do cobre e mitigar a toxicidade deste metal dentro da célula. O estudo do impacto do cobre na formação e composição de biofilme, na estrutura do peptidoglicano e na produção de ácidos teicóicos da parede (WTAs) em quatro estirpes com diferentes mecanismos de resistência ao cobre revelou que resposta ao sulfato de cobre varia consoante a estirpe. A capacidade de formação de biofilme pela estirpe produtora de biofilme (S. aureus ATCC 25923) é comprometida na presença de cobre. Em contraste, estirpes com baixa capacidade de formação de biofilme (S. aureus NRS105, ST398 e COL) apresentam uma maior formação de biofilme na presença de cobre. Adicionalmente, exposição ao sulfato de cobre induziu um aumento na produção de WTAs em todas as estirpes, embora a estirpe com a capacidade de formação de biofilme comprometida (S. aureus ATCC 25923) apresente WTAs com uma modificação diferente. Dado que os ácidos teicóicos são essenciais para a formação de biofilme em S. aureus, a incapacidade desta estirpe de formar biofilme sob stress por cobre poderá estar associada às alterações estruturais detetadas nos mesmos. Além disso, todas as estirpes apresentaram uma composição de peptidoglicano semelhante, independentemente da exposição ao cobre, sendo que os peptidoglicanos de células expostas ao cobre apresentam um maior nível de oligomerização. Isto poderá dever-se à possível ligação do cobre ao centro catalítico da hidrólase AtlA dependente de zinco, reduzindo a sua atividade. Apesar de não ser possível estabelecer uma correlação direta entre o perfil genético de resistência ao cobre e os fenótipos observados, S. aureus ATCC 25923 demonstrou menor inibição do crescimento em condições estáticas na presença de cobre.
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Palavras-chave
copper nitrite reductase AniA bacterial peroxidase cytochrome c2 spectroscopy electron transfer