Characterization of novel  factors regulating neural stem cell proliferation, temporal fate neuronal diversity

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Characterization of novel factors regulating neural stem cell proliferation, temporal fate and neuronal diversity

Publication . Marques, Graça Susete Costa de Carvalho; Homem, Catarina de Cértima Fernandes

RESUMO: O cérebro é formado por um pequeno número de células estaminais neuronais que dão origem à grande diversidade neuronal no adulto. Para que o cérebro funcione adequadamente, é importante que os neurónios certos sejam formados no momento certo. O cérebro de Drosophila provou ser um ótimo modelo para estudar o desenvolvimento cerebral pois contém um pequeno conjunto de células estaminais neuronais, os neuroblastos (NBs), que geram linhagens neuronais invariáveis ao longo de janelas de desenvolvimento precisas, tornando-se um sistema perfeito para estudar os mecanismos de diferenciação neuronal e diversidade celular. Os perfis transcricionais dos NBs e das suas linhagens são essenciais para especificar o tipo de neurónios formados. Depois dos neurónios serem formados, as suas características terminais neuronais, as quais são essenciais para o funcionamento do neurónio, começam a ser expressas e são mantidas ao longo da vida do neurónio. Assim, para que desenvolvimento cerebral ocorra corretamente, os NBs devem expressar a sequência e combinação corretas de fatores de transcrição ao longo do desenvolvimento do cérebro. Além disso, o processo de diferenciação desde os NBs até aos neurónios também precisa de ser regulado de forma precisa para que os neurónios certos possam ser formados. Embora muitos avanços tenham sido feitos nesta área, o conjunto completo de genes que regula a progressão da linhagem ainda não é conhecido, o mesmo acontece com o conjunto completo de mecanismos que levam a uma maturação e função neuronal adequadas. Os NBs dividem-se para gerar células neurais em janelas temporais bem definidas durante o desenvolvimento e uma vez que suas linhagens estejam completas, desaparecem. A altura em que os NBs desparecem difere consoante os subtipos de NBs e embora alguns dos mecanismos moleculares que levam a este desaparecimento já sejam conhecidos, como é o caso da apoptose ou autofagia, ainda não está claro a forma como esses mecanismos são coordenados temporalmente relativamente ao desenvolvimento cerebral. O Capítulo I desta tese, tem como foco os NBs do cérebro central, os quais desaparecem nos estadios iniciais de pupa. Sabe-se que a diferenciação terminal desses NBs é regulada, em parte, por um pulso da hormona ecdisona, no entanto, não se sabe se também existem fatores de transcrição temporais a regular este processo. Assim, para identificar possíveis fatores de transcrição responsáveis por regular o desaparecimento atempado dos NBs, selecionei um conjunto de candidatos e avaliei o impacto que diminuir a sua expressão tem nos NBs relativamente ao seu tempo de vida e proliferação. Apenas um destes candidatos, o TFIIFα, um membro da maquinaria de transcrição associada à RNA Polimerase II (PolII), provou ter um impacto no tempo de vida dos NBs, pois a diminuição de TFIIFα levou a que alguns NBs sobrevivessem em pupa durante mais tempo. Além disso, a diminuição dos níveis de TFIIFα em NBs também levou a defeitos na diferenciação de linhagem neuronal e na formação de células ectópicas semelhantes a NBs já em larva. Outros membros da maquinaria transcricional associada à RNA PolII, como o TFIIFβ, o TFIIB e o TFIIS, mostraram um fenótipo semelhante, indicando que a maquinaria transcricional pode desempenhar um papel importante na regulação das linhagens neuronais. No Capítulo II encontra-se descrita a criação de um atlas abrangente de sequenciação do transcriptoma de células individuais (scRNA-Seq), composto por 6 conjuntos de dados de menores dimensões, que vão desde os últimos estadios larvares até ao início da pupa. Este esforço teve como objetivo gerar um conjunto abrangente de dados transcricionais do cérebro em desenvolvimento de Drosophila, incluindo os vários estados de diferenciação dentro de uma linhagem neuronal. Este conjunto de dados inclui NBs do cérebro central e do cordão nervoso ventral, bem como as respetivas linhagens geradas dentro das janelas temporais sequenciais e restritas selecionadas. Para gerar estes dados, usei uma estratégia de marcação genética condicional, que permitiu incluir os NBs e toda a sua descendência até aos neurónios mais novos com menos de 12,5h. Embora a integração de todos os conjuntos de dados ainda não esteja concluída, este atlas representa um importante conjunto de informação para estudos futuros sobre uma grande variedade de questões biológicas, que vão desde a proliferação de NBs até à diferenciação neuronal. Por fim, no Capítulo III, foi selecionado um dos conjuntos de dados obtidos anteriormente, correspondente às 105h após a formação da larva, para estudar a diferenciação da linhagem de NBs, bem como a maturação neuronal. O objetivo desta análise consistiu em identificar fatores de transcrição que potencialmente estivessem a regular as transições entre as diferentes fases de diferenciação de uma linhagem de NBs. Curiosamente, foi identificado um estado de transição entre os NBs do tipo I e as suas células-filhas, as células-mãe ganglionares (GMCs), o qual designámos GMCs imaturas (imGMCs). Este estado de diferenciação transitório, parece ser suficientemente diferente a nível transcricional quer dos NBs quer das GMCs, de forma a permitir sua identificação independente; além disso, a presença de imGMCs mostra que a diferenciação de NBs para GMCs não é imediata, requerendo um período de transição. Ao comparar os diferentes estados de diferenciação celular de uma linhagem, pudemos identificar genes que são expressos diferencialmente em cada estado, o que os torna prováveis candidatos a desempenhar um papel importante na proliferação e diferenciação dos NBs. Além disso, o fato deste conjunto de dados incluir apenas neurónios muito jovens, permitiu o estudo das primeiras etapas da maturação neuronal. Os resultados revelaram que a maturação do neurónio começa rapidamente após a formação do mesmo e levaram à divisão do processo de maturação em 3 fases distintas com base na dinâmica transcricional de genes associados a características neuronais mais maturas, acompanhada ou não de tradução das mesmas. Consequentemente, a Fase 1 é composta por neurónios imaturos que ainda não começaram a expressar mRNA de características neuronais maturas; a Fase 2 inclui neurónios que começam a transcrever, mas não a traduzir marcadores de maturação, como genes associados a neurotransmissores; na Fase 3 da maturação neuronal, a qual é coordenada com o estadio de desenvolvimento do animal, existe expressão de mRNA, mas também de proteína, de características neuronais mais maturas. Em última análise, os resultados do trabalho apresentado nesta tese contribuíram para um melhor entendimento da progressão da linhagem neuronal e da maturação dos neurónios. Adicionalmente, os dados gerados neste estudo, representam um recurso válido e útil para a comunidade científica interessada no desenvolvimento cerebral e na diversidade neuronal.

2022-04-29Tese de doutoramento

Acesso aberto

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Fundação para a Ciência e a Tecnologia

Número da atribuição

PD/BD/114253/2016