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Projeto de investigação
Modern Structural Biology: Resources for the advancement of in-house X-ray Crystallography
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Translating the human-microbiome molecular cross-talk using glycan microarray and structural biology strategies
Publication . Trovão, Filipa; Palma, Maria Angelina; Carvalho, Ana Luísa; Liu, Yan
O microbioma intestinal humano apresenta uma elevada capacidade de utilizar como nutrientes glicanos derivados do hospedeiro e da dieta. Isto promove uma comunicação complexa com o hospedeiro humano tendo impacto na nutrição, na regulação do sistema imunológico e em mecanismos de patologia. Estirpes proeminentes da microbiota, nomeadamente como as do filo Bacteroidetes, possuem múltiplos genes codificadores de enzimas em clusters, designados polysaccharide-utilization loci (PULs). Cada PUL codifica todos os genes necessários para o reconhecimento e degradação de glicanos, incluindo enzimas ativas em hidratos de carbono (CAZYmes) ou peptidases (mucinases) com módulos auxiliares de ligação a hidratos de carbono (CBMs). No entanto, como as bactérias exploram a diversidade estrutural dos glicanos derivados da dieta e do hospedeiro e como isso influencia as interações benéficas versus patogénicas é amplamente desconhecido a nível molecular. O trabalho desenvolvido na presente Tese teve como objetivo responder a estas questões, elucidando e caracterizando o reconhecimento de glicanos por proteínas de superfície bacteriana, particularmente os CBMs, de duas bactérias modelos de intervenientes comensais do intestino, o Bacteroides thetaiotaomicron e o B. caccae, envolvidos na degradação de glicanos derivados da dieta e do hospedeiro.
Para uma melhor compreensão da comunicação molecular complexa dos comensais B. thetaiotaomicron e B. caccae com o hospedeiro humano, foi seguida uma estratégia integrativa, incluindo análise bioinformática de sequências anotadas no genoma e produção de CBMs recombinantes; descoberta de ligandos usando microarrays de glicanos com estruturas diversas de polissacáridos, glicoproteínas tipo mucina e de oligossacáridos de sequência definida; e caracterização estrutural das interações proteína-glicano identificadas usando cristalografia de raios X e outros métodos biofísicos e bioquímicos complementares. A estratégia adotada permitiu a caracterização de 2 novos CBMs: o BT0996-C, o membro fundador dos CBMs de família 97, que reconhece cadeias de ácido poligalacturónico ligadas em α1-4, um glicano derivado da dieta de polissacáridos pécticos; e o BC16100-C, um CBM da família 32 que reconhece o antigénio Tn (GalNAcα-Ser/Thr), um O-glicano do tipo mucina derivado do hospedeiro. Além disso, um novo microarray de glicoproteínas tipo mucina foi desenvolvido para high-throughput screening de novos CBMs da família 32, com o objetivo de descobrir estruturas de glicano biologicamente relevantes, seguindo a abordagem de beam search microarray. Esta abordagem contribuirá para desvendar estruturas de glicanos como mediadores específicos de interações comensais/patogénicas com impacto na saúde humana. As descobertas relatadas nesta Tese avançaram o conhecimento da interface hospedeiro-microbioma a nível molecular e podem ser exploradas para o estudo de outras estirpes microbianas e para desenvolver novas soluções em relação à saúde intestinal.
Reactivity of hypervalent iodine(III) reagents bearing a benzylamine with sulfenate salts
Publication . Dedeiras, Beatriz; Caldeira, Catarina S.; Cunha, José C.; Gomes, Clara S.B.; Marques, M. Manuel B.; DQ - Departamento de Química; LAQV@REQUIMTE; Faculdade de Ciências e Tecnologia (FCT); Beilstein-Institut
The reactivity of our recently disclosed hypervalent iodine reagents (HIRs) bearing a benzylamine with in situ-generated sulfenate salts was investigated. Under the studied conditions sulfonamides have been obtained in up to 52% yield. This reaction has been extended to a variety of HIRs and sulfenate salts to explore the different reactivity of these new reagents. A plausible mechanism is proposed, suggesting a possible radical pathway.
Elucidating the concentration-dependent effects of thiocyanate binding to carbonic anhydrase
Publication . Silva, José Malanho; Cerofolini, Linda; Carvalho, Ana Luísa; Ravera, Enrico; Fragai, Marco; Parigi, Giacomo; Macedo, Anjos L.; Geraldes, Carlos F. G. C.; Luchinat, Claudio; UCIBIO - Applied Molecular Biosciences Unit; DQ - Departamento de Química; Elsevier
Many proteins naturally carry metal centers, with a large share of them being in the active sites of several enzymes. Paramagnetic effects are a powerful source of structural information and, therefore, if the native metal is paramagnetic, or it can be functionally substituted with a paramagnetic one, paramagnetic effects can be used to study the metal sites, as well as the overall structure of the protein. One notable example is cobalt(II) substitution for zinc(II) in carbonic anhydrase. In this manuscript we investigate the effects of sodium thiocyanate on the chemical environment of the metal ion of the human carbonic anhydrase II. The electron paramagnetic resonance (EPR) titration of the cobalt(II) protein with thiocyanate shows that the EPR spectrum changes from A-type to C-type on passing from 1:1 to 1:1000-fold ligand excess. This indicates the occurrence of a change in the electronic structure, which may reflect a sizable change in the metal coordination environment in turn caused by a modification of the frozen solvent glass. However, paramagnetic nuclear magnetic resonance (NMR) data indicate that the metal coordination cage remains unperturbed even in 1:1000-fold ligand excess. This result proves that the C-type EPR spectrum observed at large ligand concentration should be ascribed to the low temperature at which EPR measurements are performed, which impacts on the structure of the protein when it is destabilized by a high concentration of a chaotropic agent.
Structural Characterization of Neisseria gonorrhoeae Bacterial Peroxidase—Insights into the Catalytic Cycle of Bacterial Peroxidases
Publication . Nóbrega, Cláudia S.; Carvalho, Ana Luísa; Romão, Maria João; Pauleta, Sofia R.; UCIBIO - Applied Molecular Biosciences Unit; DQ - Departamento de Química; MDPI - Multidisciplinary Digital Publishing Institute
Neisseria gonorrhoeae is an obligate human pathogenic bacterium responsible for gonorrhea, a sexually transmitted disease. The bacterial peroxidase, an enzyme present in the periplasm of this bacterium, detoxifies the cells against hydrogen peroxide and constitutes one of the primary defenses against exogenous and endogenous oxidative stress in this organism. The 38 kDa heterologously produced bacterial peroxidase was crystallized in the mixed-valence state, the active state, at pH 6.0, and the crystals were soaked with azide, producing the first azide-inhibited structure of this family of enzymes. The enzyme binds exogenous ligands such as cyanide and azide, which also inhibit the catalytic activity by coordinating the P heme iron, the active site, and competing with its substrate, hydrogen peroxide. The inhibition constants were estimated to be 0.4 ± 0.1 µM and 41 ± 5 mM for cyanide and azide, respectively. Imidazole also binds and inhibits the enzyme in a more complex mechanism by binding to P and E hemes, which changes the reduction potential of the latest heme. Based on the structures now reported, the catalytic cycle of bacterial peroxidases is revisited. The inhibition studies and the crystal structure of the inhibited enzyme comprise the first platform to search and develop inhibitors that target this enzyme as a possible new strategy against N. gonorrhoeae.
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Entidade financiadora
Fundação para a Ciência e a Tecnologia
Programa de financiamento
Projectos de IC&DT de Consolidação de Competências e Recursos em Investigação - 2012
Número da atribuição
RECI/BBB-BEP/0124/2012