Uncoupling heart and liver laterality events during embryogenesis.

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Uncoupling heart and liver laterality events during embryogenesis

Publication . Sampaio, Pedro Rafael Martins de Almeida; Lopes, Susana Santos; Telley, Ivo

RESUMO:Uma característica distintiva e essencial do corpo dos vertebrados é a pronunciada assimetria dos órgãos internos em relação ao eixo esquerda-direito. A decisão de que órgãos deverão ser formados do lado esquerdo ou do lado direito é estabelecida cedo durante o desenvolvimento do embrião. Este processo é iniciado num órgão especializado, chamado de Organizador esquerda-direita, também conhecido como nó em mamíferos ou vesícula de Kupffer em peixes. À superficie de cada uma das células deste órgão existe um cílio móvel ou imóvel, uma estrutura semelhante a um cabelo com um comprimento aproximado de 5µm. Enquanto que os cílios móveis do Organizador desempenham um papel crucial ao gerarem um fluxo de fluído direccional da direita para a esquerda, os cílios imóveis são considerados como potenciais sensores deste mesmo fluxo. Este evento desencadea uma resposta assimétrica de elevação de cálcio intracelular do lado esquerdo do Organizador, iniciando assim uma cascata molecular de expressão de genes da via de sinalização Nodal. Dand5, que codifica um antagonista do Nodal, é o primeiro gene a ser assimetricamente expresso, no lado direito da região do Organizador. Como resultado, o Nodal, um factor secretado da família TGF-β, torna-se activo apenas do lado esquerdo do Organizador. Devido a um mecanismo de auto-activação, a expressão assimétrica de Nodal é depois propagada anterior e posteriormente para a mesoderme lateral esquerda. Esta porção do tecido embrionário irá dar origem ao coração, vasos sanguíneos e glóbulos vermelhos. Adicionalmente, à mesoderme, o ligando Nodal também afecta o processo de especificação e desenvolvimento da endoderme, que por sua vez vai formar outros órgãos viscerais como o fígado ou o pâncreas. No entanto, os passos iniciais do estabelecimento da lateralidade ainda não são bem entendidos. A natureza do sinal que é produzido pelo fluxo de fluídos no Organizador é ainda hoje debatida. Duas teorias alternativas e não exclusivas foram propostas: o fluxo actua como força hidrodinâmica que desencadeia vias mecano-sensoriais ou, alternativamente, o fluxo como veículo de moléculas sinalizadoras que são integradas pelas células do lado esquerdo. Estudos realizados em ratinho e no peixe medaka descobriram que o complexo proteíco Pkd1l1-Pkd2 é expresso nos cílios do Organizador e é necessário para o correcto estabelecimento da lateralidade. Enquanto que a Pkd2 designa um canal catiónico nãoselectivo de cálcio, a Pkd1l1 é considerada como um receptor transmembranar mecanosensorial. Nos rins, o complexo Pkd2-Pkd1 demonstrou ter a capacidade de sentir o stress mecânico realizado pelo fluxo de urina, e de induzir sinais intracelulares de cálcio, que juntos estão envolvidos na regulação da diferenciação, crescimento e apoptose das células renais. Pkd2 e o seu parceiro Pkd1l1 também foram propostos como o complexo mecanosensor responsável pela detecção do fluxo no Organizador do ratinho, medaka e peixe-zebra e, deste modo, pelo transporte da sinalização molecular para os tecidos adjacentes. Apesar de ambos funcionarem como um complexo, foi demonstrado que a ausência do canal Pkd2 por si só é suficiente para inibir os potenciais de cálcio normalmente observados do lado esquerdo do Organizador. A interrupção da sinalização por cálcio afecta a expressão de genes da via Nodal, causando assim defeitos de lateralidade nos órgãos, tais como situs inversus que envolve a inversão total do posicionamento dos órgãos , e heterotaxia, onde um ou vários órgãos apresentam defeitos de lateralidade. Por definição estes padrões aberrantes de lateralidade, nem sempre envolvem os órgãos derivativos da mesoderme (coração) e da endoderme (sistema digestivo) simultaneamente, indicando que a posição dos órgãos internos torácicos e abdominais pode ser desacoplada molecularmente durante o desenvolvimento do embrião. Até agora, desconhece-se como o fluxo do Organizador pode estar a regular ambos os processos. Neste contexto, a disfunção ciliar tem também sido ligada a uma lista de doenças pleiotrópicas em humanos, referidas colectivamente como ciliopatias. Entre estas existe uma doença que envolve defeitos de motilidade ciliar, referida como discinesia ciliar primária (DCP), caracterizada por infecções recorrentes das vias respiratórias, sinusite, bronquiectasias e infertilidade masculina e feminina. Uma vez que o fluxo no Organizador é perturbado durante a embriogénese, aproximadamente 50% dos pacientes com DCP também apresentam defeitos de lateralidade. Em Portugal, até ao início da década de 2010, o diagnóstico desta doença não era realizado segundo as normas europeias, havendo grande risco de um diagnóstico inconclusivo ou errado para muitos destes doentes. De igual modo, o investimento feito para o estudo desta doença foi nulo ou muito reduzido, não havendo dados epidimiológicos ou patofisiológicos publicados que permitissem caracterizar a incidência desta doença na população portuguesa. Sumariamente, com este projecto de doutoramento focámo-nos em fornecer novos dados que ajudem à compreensão dos vários passos moleculares no estabelecimento de assimetria. Paralelalmente, documentamos a criação de um consórcio de várias entidades portuguesas que centralizam o diagnóstico da doença DCP na região de Lisboa, e possibilitam o estudo e caracterização das variantes fenotipicas e genéticas prevalentes no país. Primeiro explorámos a hipótese de que o estabelecimento de assimetria esquerda-direita ocorre exclusivamente através do canal catiónico Pkd2 (Capítulo 2). Uma das vantagens de usar o peixe-zebra para responder a esta pergunta é a capacidade de o manipular geneticamente em estadios de desenvolvimento precoce e ver o impacto de cada manipulação na arquitectura do Organizador (Vesícula de Kupffer), motilidade ciliar, padrão de fluxo de fluídos e posicionamento dos órgãos, tudo no mesmo embrião. Desse modo, utilizámos ferramentas genéticas para reprimir o mecanismo de sinalização de cálcio por redução da proteína Pkd2, e abolir o fluxo de fluídos no Organizador através do knockdown da Dnah7, uma proteína ciliar crucial para conferir movimento ao cílio. Em seguida, comparámos estes dois grupos ao nível da expressão génica de dand5 e lateralização dos órgãos. Os nossos resultados demonstram que a redução dos níveis da proteína Pkd2 resulta numa diminuição do comprimento ciliar, desarranjos da arquitectura do Organizador e dinâmica de fluxo anormal. A única abordagem que não afectou a arquitetura do Organizador foi quando reduzimos a Pkd2 exclusivamente das células precursoras do Organizador, no entanto, mesmo assim, foi observado um decréscimo do comprimento ciliar e velocidades de fluxo. Contudo, todas as manipulações realizadas resultaram em proporções semelhantes de defeitos de expressão de dand5 e da lateralidade dos órgãos. Assim, concluímos que a redução de Pkd2 conduz a defeitos esquerda-direita que não podem ser atribuídos exclusivamente ao seu papel putativo na mediação da mecanosensação porque ao modificar a arquitectura celular ou ao diminuir o comprimento ciliar, a ausência de Pkd2 afecta a dinâmica do fluxo no Organizador. De seguida analisámos em detalhe os passos que antecedem o estabelecimento de assimetria esquerda-direita. Apesar de todos os cílios do Organizador apresentarem competência para se tornarem móveis, apenas alguns adquirem esta funcionalidade. De acordo com resultados do nosso grupo, a decisão de móvel contra imóvel acontece através de um mecanismo mediado via sinalização Notch. Assim, observámos que apesar de a maioria dos cílios do Organizador se encontrar imóvel no seu início, estes tornam-se móveis ao longo do desenvolvimento, que consequentemente impacta na formação de um fluxo direccional e progressivamente mais forte. À luz destes resultados perguntámo-nos de qual terá de ser a força do fluxo para que a quebra da simetria inicie e em que estágio de desenvolvimento isto acontece. A fim de responder esta questão, implementámos uma estratégia inovadora que envolve a extracção mecânica do líquido do Organizador em cada fase somítica compreendida entre 3 e 12 sómitos, que equivale a um intervalo de tempo de 4 horas. Isto permitiu-nos não só abordar a importância do fluxo de fluídos ao longo de todas as fases de desenvolvimento do KV, mas também testar a importância do conteúdo do fluido. Assim, determinámos que o estabelecimento da lateralidade acontece entre os 3 e os 6 sómitos, numa janela de tempo de 1 hora e meia. Durante esses estágios de desenvolvimento o fluxo de líquido dentro do Organizador é direccional e existe um número semelhante entre cílios móveis e imóveis. A perturbação do fluxo direccional, principalmente na região anterior do Organizador, resulta numa expressão bilateral de dand5 e defeitos de lateralidade dos órgãos. Ao substituirmos o líquido presente no Organizador por uma solução tampão, observámos que não existe perturbação na determinação de lateralidade. Em conjunto, este resultados apoiam a hipótese mecano-sensora em detrimento da hipótese quemo-sensora. Adicionalmente, tanto o coração (derivado da mesoderme) como o fígado (derivado da endoderme) são igualmente afectados quando o fluxo é perturbado entre os 3 e os 6 sómitos, indicando que a sua dissociação só poderá ocorrer em fases de sinalização posteriores ao fluxo do Organizador. No Capítulo 3 relatamos uma análise comparativa entre um grupo de indivíduos saudáveis e um grupo de pacientes referidos para equipa portuguesa de diagnóstico da Discinésia Ciliar Primária (DCP). Este trabalho está integrado num estudo multidisciplinar que involve a implementação de um painel de testes para o diagnóstico e estudo da Discinésia Ciliar Primária, nomeadamente a medição do óxido nítrico nasal, microscopia electrónica, videomicroscopia de alta-velocidade, imunofluorescência e sequência genómica. O objectivo deste estudo foi determinar a gama de frequências e padrões de batimento ciliar num grupo controlo de voluntários saudáveis portugueses e num grupo de doentes portugueses com DCP. Nesse sentido, utilizámos a análise de vídeo-microscopia de alta velocidade (VMAV) para a caracterização do batimento ciliar em amostrais nasais colhidas dos indivíduos. A falta de ferramentas computacionais de livre acesso que permitissem a análise de grandes sequências de imagens obtidas por VMAV, levou-nos a criar um novo software para a detecção de frequências do batimento ciliar. Esta nova ferramenta, à qual chamámos de ‘CiliarMove’, foi validada contra o método convencional de observação directa. Demonstramos que o ‘CiliarMove’ poderá ser utilizada de forma fiável por outros centros clínicos ou de investigação em Portugal ou noutros países, para o auxílio do diagnóstico da DCP. Adicionalmente, identificámos novas variantes genéticas em doentes diagnosticados com DCP, e estabelecemos a correlação com o respectivo fenótipo ciliar. Acreditamos que no futuro, estes dados serão úteis para a criação de novas terapias direccionadas e para o melhoramento do diagnóstico desta doença. Com este trabalho identificámos de forma inequívoca qual a janela de tempo para a quebra de simetria no peixe-zebra, e caracterizámos os regimes de fluxo de fluídos no Organizador necessários para a determinação da lateralidade. Esta nova informação irá redireccionar como é que trabalhos futuros irão abordar o estudo dos eventos de quebra de simetria em peixezebra e possivelmente noutros animais modelo. Por outro lado, apresentamos uma novo grupo disciplinar para o diagnóstico da DCP, que revoluciona a compreensão da fisiopatologia e da abordagem diagnóstica desta doença em Portugal.

2021-05-06Tese de doutoramento

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Entidade financiadora

Fundação para a Ciência e a Tecnologia

Programa de financiamento

OE

Número da atribuição

SFRH/BD/111611/2015