Strategies to prevent the timely sub-cellular localization of the capsule synthetic machinery in Streptococcus pneumoniae

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Publication . Figueiredo, Joana Baptista da Silva; Filipe, Sérgio; Pinho, Mariana

A capacidade de Streptococcus pneumoniae em causar doença está normalmente dependente da presença do polissacárido capsular, também denominado de cápsula, no exterior da superfície deste organismo bacteriano. Assim, o estudo do processo que regula e realiza a síntese deste polímero é fundamental para o desenvolvimento de novas estratégias que possam ser empregues no combate a este agente patogénico humano. De forma a estudar como ocorre a coordenação da síntese da cápsula durante o ciclo celular bacteriano, tornou-se necessário o desenvolvimento de novas ferramentas que permitissem a localização de proteínas específicas em bactérias, durante o processo de divisão bacteriana. Para isso, construímos várias ferramentas que permitem a fusão de proteínas de interesse com proteínas fluorescentes em S. pneumoniae, que podem ser usadas noutras bactérias Gram-positivas. Através da manipulação da estrutura e da estabilidade do terminal 5′ da molécula de mRNA, e consequentemente do acesso do ribossoma a esta molécula, foi possível garantir a expressão de proteínas fluorescentes de modo a obter um sinal de fluorescência intenso. Em quase todos os serótipos de pneumococos, a regulação da síntese da cápsula está a cargo das proteínas Wzd e Wze, que co-localizam no septo bacteriano e que garantem a expressão da cápsula nesse local. Neste trabalho, observámos uma interação entre a proteína Wzg, a ligase que está envolvida na ligação da cápsula à parede bacteriana, e a proteína reguladora Wzd. Propusemos que o par Wzd/Wze garante que a bactéria está totalmente envolvida pela cápsula através do recrutamento da proteína Wzg para o septo. Um maior número das enzimas Wzg no septo poderá ajustar o ritmo de ligação da cápsula ao peptidoglicano com o ritmo a que o peptidoglicano é sintetizado. De acordo com este modelo, mutantes em que o gene wzd foi deletado, não apresentam cápsula no septo de divisão, mas mantêm a presença deste polímero na superfície lateral. A ausência de cápsula no septo de divisão parece ser suficiente para tornar as bactérias suscetíveis à lise induzida por hidrolases de peptidoglicano e para diminuir a sua capacidade de causar doença no modelo de infeção de embrião de Danio rerio (peixe-zebra). Estes resultados indicam que ao impedir o completo envolvimento da bactéria pela cápsula, mesmo que de forma transiente ou num local específico, poderemos conseguir facilitar a eliminação de bactérias devido à exposição da parede bacteriana. Uma vez que a presença do par Wzd/Wze é fundamental para que S. pneumoniae consiga causar doença num hospedeiro infetado, decidimos desenvolver um método que permitisse a identificação de compostos capazes de impedir esta interação do par Wzd/Wze no septo de divisão. Para isso, construímos uma estirpe que produz as proteínas Wzd e o Wze ligadas a diferentes proteínas fluorescentes. Assumimos que caso a interação destas proteínas fosse inibida, os sinais de fluorescência associados à proteína Wzd e à proteína Wze, em vez de estarem co-localizados no septo de divisão, estariam espalhados, respetivamente, pela membrana celular e pelo citoplasma. A aplicação deste método foi bem-sucedida dado que a análise de um pequeno número de compostos testados permitiu a identificação de um candidato promissor. Esta tese demonstrou que as bactérias de S. pneumoniae precisam de estar completamente envolvidas por uma cápsula de modo a assegurar a sua sobrevivência na presença de enzimas capazes de degradarem o seu peptidoglicano, ou na presença do sistema imunitário do hospedeiro, e permitiu a identificação de um método para a identificação de compostos que impedem o correto processo de síntese da cápsula.

2022-05-19Tese de doutoramento

Acesso aberto

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Entidade financiadora

Fundação para a Ciência e a Tecnologia

Número da atribuição

SFRH/BD/103181/2014