A new target inside an old molecule: glutamate amidation of peptidoglycan

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A new target inside an old molecule: Glutamate amidation of peptidoglycan

Publication . Gonçalves, Bárbara Vitorino; Almeida, Rita; Mota, Luís

Staphylococcus aureus é uma bactéria responsável por várias infeções humanas devido à sua capacidade de expressar vários fatores de virulência. Este organismo torna-se ainda mais perigoso devido à sua capacidade de adquirir resistência a todos os antibióticos utilizados na prática clínica. O complexo MurT-GatD é responsável pela amidação do segundo aminoácido do pentapéptido, onde D-iso-glutamato é convertido em D-iso-glutamina. A inibição desta modificação afeta vários processos fisiológicos que são importantes para a sua sobrevivência, como o crescimento celular, resistência a antibióticos β-lactâmicos e à lisozima, tornando este complexo um potencial alvo para o desenvolvimento de uma molécula com atividade antimicrobiana. No entanto, o mecanismo através do qual as proteínas MurT-GatD interagem e como realizam a reação catalítica, bem como o impacto da amidação do peptidoglicano na interação com o hospedeiro são questões que ainda faltam responder. Esta tese teve como objetivo descrever como se processa a interação física entre MurT e GatD e compreender o potencial de virulência da amidação do peptidoglicano. Através de várias técnicas genéticas e bioquímicas concluímos que o domínio C-terminal do MurT (DUF1727) é o domínio de ligação entre o MurT e GatD. Além disso, identificámos quatro aminoácidos do DUF1727 importantes para a formação do complexo (W352, Y354, L381 e R375), dois importantes para a estabilidade do MurT (D346 e D349) e três importantes para a atividade de MurT-GatD (D355, Y418 e L313). Esta informação contribuirá para o futuro desenvolvimento de moléculas que impeçam a interação física entre MurT e GatD e consequentemente possibilite a eliminação de S. aureus. Em relação ao impacto da amidação do peptidoglicano, em contexto de virulência, procedeu-se á infeção de macrófagos com vários mutantes murT-gatD construídos em diferentes estirpes de S. aureus. Após inibição dos genes murT-gatD observaram-se diferentes fenótipos consoante a origem genética das estirpes. Demonstrou-se que estes genes são importantes para a evasão de macrófagos nas estirpes COL e MW2 e para a sobrevivência dentro dos macrófagos para a estirpe COL, contudo não para a estirpe HDE288. Para correlacionar estes resultados com o impacto específico da amidação do peptidoglicano nas várias origens genéticas de S. aureus estudadas, o impacto da agregação celular, formação do biofilme e resistência à lisozima foram analisados. Para além disso, o efeito de condições específicas relacionadas com o hospedeiro como diferentes valores de pH, níveis de oxigénio e azoto na amidação do peptidoglicano foram também analisadas. Em relação à expressão do murT-gatD, a atividade do promotor do operão foi analisado. Observou-se que a ausência do substrato de GatD, pH externo ácido e a presença de cobre resultam em diferentes alterações no padrão de expressão deste operão. Determinar como a amidação do peptidoglicano afeta a interação de S. aureus com as células do hospedeiro e como pode contribuir para a virulência desta bactéria será fundamental para validar o complexo MurT-GatD como um alvo para o desenvolvimento de um novo antibiótico.

2022-12-20Tese de doutoramento

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Entidade financiadora

Fundação para a Ciência e a Tecnologia

Programa de financiamento

OE

Número da atribuição

SFRH/BD/131623/2017