Domain dynamics and control of electron flux of NADPH cytochrome P450 oxidoreductase

Abstract

A NADPH citocromo P450 oxidoredutase (CPR) é o fornecedor electrónico obrigatório para os citocromos P450 (CYPs) microssomais. Estes desempenham um papel central no metabolismo de hormonas esteróides, vitaminas, fármacos e outros xenobióticos. Demonstrou-se que a CPR existe num equilíbrio conformacional dinâmico, altamente dependente da força iónica, determinante para a sua função de transferência eletrónica (TE). A CPR transita entre uma conformação compacta (estado fechado) e conformações abertas (estado aberto). Admite-se que uma secção específica de um domínio funcional da CPR, conhecida como segmento hinge (“dobradiça”), desempenhe um papel importante na dinâmica e TE da CPR. O principal objetivo deste trabalho de Doutoramento foi estudar o papel de resíduos específicos da hinge no equilíbrio conformacional da CPR, o seu papel no efeito da força iónica na dinâmica aberto-fechado e na interacção com diversos parceiros redox estruturalmente diversos. Para tal, foram construídos oito mutantes, visando os resíduos da hinge G240, S243, I245 e R246, com o objetivo de modificar a flexibilidade e potenciais interações iónicas. Verificou-se o efeito destas mutações na CPR na forma solúvel ou membranar, medindo a redução da proteína solúvel citocromo c a várias concentrações de sal. Todos os mutantes foram capazes de reduzir o citocromo c ainda que com diferentes eficiências, no entanto, as taxas de redução máxima foram deslocadas para concentrações de sal menores. Os resultados levam-nos a admitir a hipótese de uma rede de pontes de hidrogénio em torno do resíduo R246, envolvido na dinâmica aberto-fechado. Curiosamente, os efeitos das mutações, embora semelhantes, demonstraram diferenças entre formas solúveis e membranares da CPR. Os resultados demonstraram o aspecto crítico das propriedades eletrostáticas e de flexibilidade da hinge para a função de TE da CPR. Embora a utilização de um parceiro redox substituto, citocromo c, tenha sido informativo, a CPR pode funcionar de maneira diferente com os seus aceitadores naturais. Por conseguinte, foram selecionados três mutantes da CPR (S243P, I245P, R246A), e combinados com três CYPs representativos do metabolismo de fármacos, nomeadamente as isoformas 1A2, 2A6 ou 3A4. Diferentes abordagens experimentais foram empregues para verificar o efeito dessas mutações na funcionalidade dos CYPs: capacidade de bioactivação de pré-carcinogénios, cinética enzimática, efeito da força iónica e competição do citocromo b5 (CYB5). As mutações na hinge influenciaram a bioactivação de pré-carcinógénios de um modo dependente da isoforma do CYP e até do substrato. Os desvios nos parâmetros cinéticos dos três CYPs quando combinado com cada enzima mutante, tendem a confirmar essa discrepância. Isto foi ainda confirmado pelos perfis de sal/actividade, específicos para cada CYP e mutante hinge. As experiências de competição CPR:CYB5 indicaram um papel menos importante da afinidade na dinâmica aberto-fechado. Juntos, os dados sugerem que a hinge é responsável pela existência de um agregado de diferentes conformações abertas, permitindo a interacção e TE com parceiros redox estruturalmente variados. Globalmente, este trabalho de doutoramento identificou resíduos-chave da hinge importantes na dinâmica e na função da CPR. Os dados obtidos suportam a existência de um mecanismo molecular subjacente que permite à CPR a TE para parceiros redox estruturalmente diversos, uma questão intrigante que estava pouco clara até agora.

NADPH cytochrome P450 oxidoreductase (CPR) is the obligatory electron supplier for all microsomal cytochrome P450s (CYPs). These play a central role in the metabolism of steroid hormones, vitamins, therapeutic drugs and other xenobiotics. CPR has been shown to exist in a dynamic conformational equilibrium, highly dependent on ionic strength conditions, determinant for its electron-transfer (ET) function. CPR transitions between a compact conformation (locked state) and open conformations (unlocked state). A specific section of one of CPR’s functional domains known as the hinge segment has been postulated to play a major role in CPR’s dynamics and ET. The main goal of this PhD-research was to study the role of specific residues of the hinge in the conformational equilibrium of CPR, their role in the ionic strength effect of the open-closed dynamics and in the interaction of CPR with structural diverse redox partners. For this purpose, eight mutants were constructed, targeting hinge residues G240, S243, I245 and R246, with the aim of modifying flexibility and potential ionic interactions. The effect of these CPR mutations were verified either in a soluble or in its membrane bound form, measuring the reduction of the soluble protein cytochrome c at various salt concentrations. All mutants were found capable of reducing cytochrome c yet with different efficiencies, however maximal reduction rates were shifted to lower salt concentration. Results lead us to hypothesize a hydrogen bond network around residue R246, involved in the open/closed dynamics. Interestingly, the effects of mutations, although similar, demonstrated specific differences between soluble and membrane-bound CPR forms. Results demonstrated the critical aspect of electrostatic and flexibility properties of the hinge for CPR’s ET function. Although the use of the surrogate redox partner cytochrome c was informative, CPR may function differently with its natural acceptors. Therefore, three CPR hinge mutants were selected (S243P, I245P and R246A) and combined with three representative drug-metabolizing CYPs, namely isoforms 1A2, 2A6 or 3A4. Different experimental approaches were employed, to verify the effect of these hinge mutations on CYP functionality: bioactivation capacity of pre-carcinogens, enzyme kinetic analysis, effect of ionic strength and cytochrome b5 (CYB5) competition. The hinge mutations influenced the bioactivation of pre-carcinogens, which seemed CYP-isoform and even substrate dependent. The deviations of enzyme kinetic parameters of the three CYPs when combined with each of the mutants, tend to confirm this discrepancy. This was further confirmed by the CYP-isoform and hinge mutant specific salt/activity profiles. The CPR/CYB5 competition experiments indicated a less important role of affinity in the open/closed dynamics. Together data suggest that the hinge is responsible for the existence of a conformational aggregate of different open CPR conformers, enabling ET-interaction with structurally varied redox partners. Overall, this PhD research has uncovered several key residues of the hinge in CPR’s protein dynamics and function. The obtained data seem to support an underlying molecular mechanism, permitting CPR’s ET to structurally diverse redox partners, an intriguing issue which has been unclear so far.