Actividade funcional dos neutrófilos durante a infecção por Leishmania infantum

Abstract

A presente dissertação tinha como objectivo geral aprofundar o papel desempenhado pelos neutrófilos durante as fases iniciais nainfecção por L. infantum, contribuindo para o esclarecimento dos mecanismos de activação da imunidade inata e adaptativa. O estudo foi programado de acordo com três objectivos específicos, cujo desenho experimental, resultados e respectivas discussões se encontram descritos nos capítulos 2, 3 e 4. No capítulo 1 foi efectuada uma introdução teórica sobre a patogénese da leishmaniose visceral, revendo os trabalhos relacionados com a interacção parasita-hospedeiro e focando o papel dos PMN, durante a infecção com Leishmania. No capítulo 2 foi avaliado o efeito do parasita nos mecanismos imunológicos de neutrófilos, através daanálise da fagocitose, respiração oxidativa, apoptose, quimiotaxia, desgranulação e expressão de citocinas, quimiocinas e receptores toll-like. Por outro lado,foi também analisadaa influência dos neutrófilos na viabilidade e no crescimento do parasita.Verificou-se que o parasita induz a activação de algumasdasvias da imunidade inata dos PMN,nomeadamente mecanismos oxidativos e não oxidativos como a produção de ião superóxido e a exocitose das enzimas proteolíticas, NE e CatG.Porém,os parasitas maisaptos parecem causara inibição da migração dos PMNe de mecanismos que levam à activação de outras subpopulações celulares, incluindo a expressão de quimiocinas (MIP-1α), citocinas (TNF-α, IL-6 e IL-1β) ou do receptor toll-like2, comprometendo o vínculonatural entre a imunidade inata e a adaptativa. No capítulo 3 foi dissecada a interacção M-PMNdurante a infecção in vitropor L. infantum, através da análise da capacidade fagocitária, expressão de citocinas, quimiocinas e receptores toll-likeem macrófagos, e produção de metabolitos do óxido nítrico. Verificou-seque L. infantuminduz a activação da resposta imunológica através da via de estimulação do TLR-4 de Mmodulando a expressão de quimiocinas e citocinas pró (TNF-α e IL-6) e anti-inflamatórias(TGF-β), potenciadapela presença inicial de PMN. Oparasita parece também bloquear a produção de NO,ena fase inicialda infecção e na presença de PMN este bloqueio, associadoa níveis reduzidos da citocina pro-inflamatóriaIL-1β e da quimiocina MCP-1, induz um fenótipo anti-inflamatório, possivelmente para evitar o excesso de resposta inflamatória que advém da colaboração entre PMN e M. Todavia, o decréscimo drástico doparasitismo macrofágicodeverá estar relacionado comoutros factores imunológicos que podem ser potenciados pela cooperação dos Mcom os PMN e/ou interacção prévia dos PMN com o parasita. No capítulo 4 foi avaliadoin vivoo papel dos PMN durante o início da infecção experimental por L. chagasi,através daimunofenotipagem das populações leucocitárias recrutadas para o local da inoculação dos parasitas, da determinação da presença do parasita e da quantificação da expressão de citocinas em órgãos internos após deplecção de PMN. Observou-se que a ausência dePMN, apesar de não influenciar as populações leucocitárias no local de infecção, parece retardar a remoção dos parasitas e afectar a possível migração de leucócitos parasitados para os órgãos internos, nomeadamente para os gânglios cervicais. No entanto,em qualquer das situações há disseminação dos parasitas para os gânglios.A deplecção de PMN parece também influenciaro perfil de citocinas induzidaspeloparasita no início da infecção, conduzindo à expressão de citocinas pró e anti-inflamatórias (IL1-β, TNF-α, TGF-β e IL-17). A produção de granzima B juntamente com a inibição de IFN-γ numa fase posterior da infecção, é ainda um reflexo possível da ausência inicial de PMN. Resumindo, na infecção por L. infantumos PMN, estão envolvidos no controlo inicial de uma parte dos parasitas, enquanto outros, provavelmente os mais virulentos, conseguem subsistir, reinfectar novas células e passar para as células hospedeiras definitivas, os Mque são recrutados ao local de infecção através do estímulo provocado por quimiocinas. Os M, por sua vez, expressam o receptor de reconhecimento toll-like4 e citocinas pró-inflamatórias associadas à inibição da expressão da IL-1β. Numa fase posterior da infecção, a expressão de TLR-4 mantém-se mas a carga parasitária diminui drasticamente. Independentemente da presença de PMN no local de infecção, os parasitas são disseminados para os órgãos linfóides, porém, os PMN influenciam a regulação da complexa sinalização de citocinas nestes órgãos. Este trabalho evidência o papel crucial dos PMN no desencadear da resposta imunológica na infecção por L. infantum, sendo a primeira barreira de controlo contra o parasita através da indução dos mecanismos de imunidade inata, recrutamento e estimulação de outras células, nomeadamente MΦ e linfócitos.

The present work aimed to deepen the role of neutrophils during the early stages of L. infantuminfection and to contributeto the elucidation of activation mechanisms of innate and adaptive immunity. The study was plannedin accordance with threespecific objectives described in Chapters 2, 3 and 4.Chapter 1 describes the pathogenesis of visceral leishmaniasis, reviewing the host-parasite interaction,focusing on the role of PMN during Leishmaniainfection.In Chapter 2 the effect of the parasite onneutrophilimmune mechanismsis delineated, through the analysis of phagocytosis, oxidative burst, apoptosis, chemotaxis, degranulation and expression of cytokines, chemokines and toll-likereceptors. The influence of neutrophils onparasite viabilityand growthwas also analyzed. It wasfound that Leishmaniainducedthe activation of some pathways of PMN innate immunity, which includesoxidative and non oxidative mechanisms such as,production of superoxide ion and exocytosis of proteolytic enzymes, NE and CatG. However, the more fitparasites seemedto cause the inhibition of PMN migration and the mechanisms that lead to activation of other leukocytepopulations, including the expression of chemokines (MIP-1α), cytokines (TNF-α, IL-6 and IL-1β)or toll-like 2 receptor, affecting the natural link between the innate and adaptive immunity.Chapter 3 dissectsthe MΦ-PMN interaction during in vitroinfection by L. infantumthrough the analysis of phagocytosis capacity, expression of cytokines, chemokines and toll-likereceptors in MΦ, and the production of metabolites of nitric oxide. It was found that L. infantuminduced the activation ofimmune response through the stimulation of MΦTLR-4,modulating the expression of pro-inflammatory chemokines and cytokines (TNF-αand IL-6) and anti-inflammatory (TGF-β), boosted by the initial presence of PMN. The parasite also blocksthe production of NO in the early phase of infection and in the presence of PMN. This blockade associated to reduced levels of IL-1βand MCP-1,favor an anti-inflammatory macrophage phenotype that may prevent the excessive inflammatory response resulting fromthe cross talk between PMN and MΦ. However, the drastic decrease of macrophage parasitism should be related to other immunological factors that can be enhanced by MΦ-PMN cooperation and/orPMN interaction with the parasite.Chapter 4 accessesin vivothe role of PMN during the early stageof L. chagasiexperimental infection by immunophenotyping leukocyte populations recruited to the site of parasite inoculation, determining the presence of the parasite andquantifying cytokine expression in internal organs after PMN depletion. It was observed that absence of PMN, while not influencing the leukocyte population at the site of infection, appearedto slow the removal of parasites,affecting the possible migration of leukocytes to internal organs (cervical lymph nodes). However, in either situation, there is dissemination of parasites to the lymph nodes. PMN depletion also appearedto influence the cytokine profile induced by the parasite duringtheearly phase of infection, leading to the expression of pro and anti-inflammatory cytokines (IL1-β, TNF-α, TGF-βand IL-17). The production of granzyme B along with the inhibition of IFN-γat a later stage of infection still wasa reflectof the initial PMNdepletion.In short, PMN are involved in the initial control of L. infantuminfection by causing the destruction of some of the parasites. While others, probably the most virulent, cansubsist, reinfect new cells and transferinto the definitive host cells,the MΦthat are recruited to the site of infection through the stimulation caused by chemokines. The MΦ, in turn, express the recognition receptor toll-like4 and pro-inflammatory cytokines associated to inhibition of expression of IL-1β. At a later stage of infection, the expression of TLR-4 remains but the parasite load decreases dramatically.Regardless of the presence of PMN at the site of infection, the parasites are spread to lymphoid organs, however, PMN influence the regulation of the complex cytokine signaling in these organs.This study highlights the crucial role of PMN in triggering the immune response to L. infantuminfection, being the first control barrier against theparasitebyinductinginnate immune mechanisms, recruitment and stimulation of other cells, including lymphocytes and MΦ