Estudo do tráfego nucleocitoplasmático do vírus da hepatite delta

Abstract

O vírus da hepatite delta (HDV) é o agente etiológico responsável pelas formas mais graves e mortais de doença viral hepática para as quais não existe uma terapia eficaz. O virião do HDV é formado por uma molécula de RNA circular e de cadeia simples associada a múltiplas cópias do antigénio delta e pelos antigénios de superfície do HBV (HBsAg). Os HBsAgs são glicoproteínas associadas ao reticulo endoplasmático das células e são indispensáveis para a montagem e empacotamento de partículas delta infecciosas capazes de infecção e transmissão. A replicação do genoma do HDV ocorre no núcleo das células por um mecanismo de círculo rolante, onde o RNA genómico do vírus serve de molde à síntese de moléculas multiméricas de RNA antigenómico, as quais possuem actividade ribozímica e se auto-clivam a intervalos precisos. Após clivagem, os antigenomas monoméricos religam-se e servem de molde à síntese de novas cadeias de RNA genómico por um mecanismo semelhante. Tanto o RNA como os HDAgs acumulam-se preferencialmente no núcleo das células. No entanto, a interacção das RNPs do HDV com os HBsAgs tem lugar exclusivamente no citoplasma. Foi demonstrado que as RNPs do HDV fazem um vai-vém contínuo entre o núcleo e o citoplasma e que a exportação nuclear das RNPs virais é um processo independente da presença de HBsAg, sendo mediado pelo RNA do HDV. O mecanismo oposto, ou seja, a importação das RNPs do HDV é um mecanismo mediado pelos antigénios delta que envolve o reconhecimento de sinais de localização nuclear pelas proteínas celulares especializadas no transporte nuclear através do poro nuclear.O presente trabalho teve como objectivo identificar os sinais presentes no RNA do HDV e nos HDAgs, e as proteínas celulares envolvidas no transporte núcleo-citoplasmático das RNPs do vírus. Com o objectivo de identificar os elementos de exportação nuclear presentes no RNA do HDV procedeu-se à construção e expressão de uma série de mutantes de deleção de um plasmídeo (pDL542) que codifica exclusivamente para o RNA genómico do vírus. Para a construção dos mutantes de deleção utilizou-se uma abordagem que se baseia na utilização da exonuclease III (Exo III). Os cDNAs do HDV com dimensões progressivamente menores, resultantes da digestão com a Exo III, foram clonados e utilizados para transfectar células Huh7. A identificação dos RNAs defectivos na exportação nuclear foi efectuada por comparação do padrão de distribuição intracelular de cada mutante de deleção com a localização do RNA genómico do HDV do tipo selvagem, através de experiências de hibridação in situ. A presença de sinais de exportação nuclear no RNA do HDV foi também estudada por quantificação dos níveis de expressão da proteína CAT em extractos de células transfectadas com o vector repórter pDM138, no qual foram inseridos vários fragmentos de cDNA que codificam para diferentes partes do RNA genómico e antigenómico do vírus. Como resultado da transcrição do vector repórter pDM138 são produzidos mRNAs que possuem a ORF da proteína CAT inserida numa região intrónica do genoma do HIV-1. A exportação e acumulação citoplasmática destes mRNAs depende da presença de sequências funcionais na exportação e está correlacionada com o aumento dos níveis da expressão da proteína CAT. Deste modo, a presença de um sinal de exportação numa sequência de RNA pode ser facilmente investigada por quantificação da proteína repórter CAT. O estudo da distribuição intracelular dos RNAs produzidos a partir dos mutantes de deleção do plasmídeo pDL542 não permitiu identificar nenhuma sequência no RNA genómico do vírus essencial para a exportação nuclear, uma vez que todos os mutantes de deleção do RNA genómico do HDV apresentam o mesmo padrão de distribuição intracelular do RNA genómico do tipo selvagem. No entanto, registou-se uma redução significativa no número de células transfectadas em que o RNA viral foi detectado no citoplasma, quando se analisaram as formas truncadas do RNA genómico sem as sequências compreendidas entre os nucleótidos 1211 e 1487, e 476 e 512. Os resultados dos ensaios de quantificação da expressão da proteína CAT após transfecção de células Huh7 com os vectores pDM138 que codificam para diferentes partes do RNA genómico do HDV mostraram a presença de três sequências no genoma do vírus capazes de causar um aumento na expressão da proteína CAT superior ao observado em células transfectadas com o vector pDM138 parental. Duas das sequências analisadas (nt 1191-1414 e 415-613) sobrepõem-se parcialmente com as regiões identificadas no genoma do HDV, na ausência das quais se observa uma redução significativa na percentagem de células com marcação citoplasmática. Em conjunto, estes resultados poderão indicar que o RNA genómico possui mais do que um elemento cis envolvido na exportação nuclear e que a eficiência do transporte do núcleo para o citoplasma está relacionada com o número de sinais de exportação presentes no genoma do vírus. A aplicação da mesma abordagem experimental para a pesquisa de sinais de exportação no antigenoma do HDV mostrou que este RNA viral possui um elemento cis, situado entre os nt 1263 a 1466, funcionalmente equivalente ao PRE do HBV. A actividade do sinal de exportação do antigenoma do HDV parece depender, da orientação da sequência identificada em relação à ORF da proteína CAT e da exportina CRM1. Demonstrou-se ainda, que o aumento da expressão da proteína repórter, induzido pela sequência compreendida entre os nt 1263 e 1466 do RNA antigenómico do HDV, resulta da exportação e acumulação citoplasmática de mRNAs repórter contendo a ORF da proteína CAT inserida no intrão. Estes ensaios foram conduzidos na ausência de replicação viral e consequente acumulação dos HDAg, sugerindo que os antigénios delta não são necessários para o transporte do RNA antigenómico do HDV do núcleo para o citoplasma. A análise funcional do elemento de exportação no transporte do RNA antigenómico para o citoplasma foi efectuada por comparação da distribuição intracelular do antigenoma do HDV com e sem o sinal de exportação nuclear. A redução de 60% na proporção de RNA no citoplasma em relação à quantidade de RNA antigenómico nas fracções nucleares, avaliada por qRT-PCR, mostra que o sinal de exportação situado entre os nt 1263 e 1466 altera a distribuição do antigenoma do HDV. Adicionalmente, utilizando uma abordagem similar demonstrou-se que os RNAs genómicos e antigenómicos do HDV, na ausência de replicação do vírus, são exportados em quantidades semelhantes. A abordagem utilizada para a identificação das sequências de aminoácidos do HDAg necessárias para a importação nuclear consistiu na expressão de diferentes subregiões do cDNA do HDAg clonadas na mesma grelha de leitura do gene da proteína repórter c-myc-PK que, na ausência de NLS funcionais, se acumula exclusivamente no citoplasma das células. Após análise detalhada dos aminoácidos do HDAg necessários e suficientes para promover a importação nuclear da proteína c-myc-PK confirmou-se a importância do NLS identificado na localização intracelular do HDAg nativo.Neste trabalho, obtiveram-se evidências sólidas que a importação nuclear do HDAg é dirigida por um único NLS, constituído por uma sequência contínua de 10 aminoácidos (EGAPPAKRAR), que se situam nas posições 66 a 75 na proteína. Esta sequência corresponde ao primeiro domínio do NLS bipartido anteriormente identificado no HDAg como sendo essencial para a importação nuclear de uma proteína repórter, diferindo apenas pela presença de um resíduo de ácido glutâmico adicional. Foi ainda demonstrado, que o NLS do HDAg não é específico para células hepáticas. As experiências de cromatografia de afinidade e de espectrometria de massa realizadas com o objectivo de identificar as proteínas celulares que interagem especificamente com o NLS do HDAg não permitiram elucidar o mecanismo pelo qual o antigénio delta é importado para o núcleo. Contudo, a identificação de proteínas de ligação a elementos do citoesqueleto poderá indicar o envolvimento desta estrutura no mecanismo de importação nuclear dos HDAg e das RNPs do HDV.

The hepatitis delta virus is the causative agent of one of the most severe and mortal forms of virus-induced liver disease for which there is no effective treatment. HDV infectious particles consist of a circular ssRNA molecule of about 1.7 Kb, small and large delta antigens, and hepatitis B surface antigens (HBsAgs). The HBsAgs are localised in the cytoplasm inside the endoplasmic reticulum and are essential in assembly of hepatitis delta virus particles capable of infection and transmission. HDV genome replication occurs in the nucleus via a rolling-circle mechanism where the incoming genome serves as a template for production of complementary multimeric antigenomic RNA that harbour ribozymes capable of self-cleaving at precise monomeric intervals. After cleavage, the resulting monomeric antigenomes recircularize and are used as templates for genome synthesis by a similar mechanism. Both HDV RNA and HDAg accumulate preferentially in the cell nucleus. Nevertheless, the interaction between HDV RNPs and HBsAgs takes place in the cytoplasm. It was shown that HDV RNPs shuttle continuously between the nucleus and the cytoplasm and nuclear export of HDV RNPs is a mechanism independent of the presence of HBsAgs, possibly being mediated by the virus RNA. In contrast, HDV RNPs nuclear import is a process mediated by HDAg that relies on nuclear localization signal recognition by the cellular proteins specialised in the nuclear transport across the nuclear pore. The main objective of this work was to identify the signals present on the HDV RNA and HDAgs, and the cellular proteins involved in the nucleocytoplasmic traffic of HDV RNPs. In order to identify the cis elements responsible for HDV RNA export we constructed and expressed a series of sequential deletion mutants of a plasmid (pDL542) that exclusively encodes for the genomic HDV RNA. For the construction of HDV cDNA deletion mutants we employed a strategy that utilizes the enzyme Exo III. The resulting cDNAs fragments were then subcloned and used to transfect Huh7 cells. The screening procedure to identify virus RNAs defective in nuclear export was performed comparing the intracellular distribution pattern of each deletion mutant to the wild type HDV genomic RNA. The presence of export signals on HDV RNA was further investigated by quantification of CAT protein expression after transfection of Huh7 cells with pDM138 reporter plasmids containing several cDNA fragments that code for different parts of genomic and antigenomic HDV RNA. The mRNA molecules derived by transcription of pDM138 reporter plasmid contain the CAT gene inserted within the second intron of HIV-1 sequence. Export and cytoplasmic accumulation of the unspliced reporter mRNAs depends on the presence of a functional transport element and is correlated to an increase in CAT protein expression. Therefore, the export activity of a RNA sequence can be easily determined by quantifying the CAT protein expression levels after transfection. Analysis of intracellular distribution pattern by in situ hybridization assays of the HDV RNAs produced by plasmid pDL542 deletion mutants did not allow us to identify any sequence motifs essential for HDV RNA nuclear export. All of the deletion mutants analysed displayed the same pattern of distribution as observed for wild type HDV genomic RNA. However, we noticed a significant reduction in the number of cells displaying cytoplasmic staining when HDV RNA deletion mutants without the sequences comprising nucleotides 1211 to 1487 and 476 to 512 were analysed. Quantification of CAT protein expression after transfection with pDM138 vectors coding for different parts of genomic HDV RNA showed the presence of three sequences in the virus genome capable of enhancing CAT protein expression above the background level detected in cells transfected with empty plasmid pDM138. Two of the sequences tested (nt 1191-1414 and 415-613) partially overlap the regions identified in genomic HDV RNA by deletion analysis that cause a reduction in the percentage of cells displaying cytoplasmic staining for virus RNA. Taking together, these studies suggest that HDV genome possibly contains more than one nuclear export signal and the efficiency of HDV RNA nuclear export may be related to the number of export signals present in virus genome. Using the same approach to search for export motifs in the virus antigenome we found that antigenomic HDV RNA contains a cis element, localised between nucleotides 1263 and 1466 that is functionally equivalent to HBV PRE. The activity of the HDV antigenome export signal seems to be orientation-dependent and may rely on CRM1 function. We also showed, that the increment in expression of the reporter protein induced by the sequence comprising nt 1263 to 1466 of antigenomic HDV RNA results from nuclear export and cytoplasmic accumulation of reporter mRNAs that carry the ORF of the reporter protein within the intron.The experiments described above were conducted in the absence of viral replication and the consequent accumulation of HDAg, implying that delta antigens are not necessary for the transport of antigenomic HDV RNA from the nucleus to the cytoplasm. The functional analysis of the identified transport element in transport of HDV antigenome to the cytoplasm was performed by comparing the intracellular distribution of antigenomic HDV RNA with or without the nuclear export signal, by qRT-PCR experiments. We observed, a 60% reduction in the proportion of RNA detected in the cytoplasm relative to the amount of antigenomic HDV RNA in the nuclear fractions of Huh7 cells transfected with a construct that expresses HDV antigenome without the export element. These results show that the sequence between nucleotides 1263 and 1466 interferes with intracellular distribution of HDV antigenome. Additionally, using an identical approach we demonstrated that genomic and antigenomic HDV RNA in the absence of virus replication are exported at similar amounts to the cytoplasm. The strategy adopted for identification of the amino acid sequence in HDAg necessary for nuclear import consisted in expression of different portions of HDAg cDNA fused in frame with the coding sequence for c-myc-PK protein, which untagged to a functional NLS localises solely in the cytoplasm. After the identification and characterization of the minimal amino acid sequence in the delta antigen capable of promoting nuclear import of c-myc-PK we analysed the functional importance of the NLS identified here in the intracellular localization of the native HDAg. We obtained strong evidence that nuclear import of HDAg is directed by a 10-amino acid NLS (EGAPPAKRAR), located in positions 66-75. This sequence corresponds to the first amino acid stretch, differing only in the presence of an additional glutamic acid residue, of a bipartite NLS previously identified in HDAg and considered to be essential for nuclear localization of a reporter protein. We also demonstrated that HDAg NLS Is not specific for hepatic cells. The affinity chromatography experiments followed by mass spectrometry performed in order to identify the cellular proteins that interact with the HDAg NLS did not allowed to elucidate the mechanism of HDAg nuclear import. However, the identification of cytoskeleton binding proteins as HDAg NLS interacting partners may indicate the involvement of this structure in the mechanism of HDAg and HDV RNPs nuclear import.