Estudo da influência dos siRNAS na replicação do vírus da hepatite delta e análise da expressão genética em células infectadas

Abstract

O vírus da hepatite delta (HDV) é o único vírus satélite humano conhecido até à data e membro do género Deltavirus. A replicação do HDV ocorre de forma independente da replicação do vírus da hepatite B (HBV) no entanto para formar partículas infecciosas o HDV necessita das proteínas de superfície do HBV. Após a entrada no núcleo o RNA genómico de cadeia simples do HDV replica por um mecanismo de círculo rolante com a produção da cadeia de RNA complementar, o RNA antigenómico. O HDV apenas codifica uma proteína da qual existem duas formas, o antigénio pequeno e o antigénio grande. Apesar de ambos os antigénios partilharem grande parte da cadeia de aminoácidos eles possuem papéis distintos na replicação do HDV. O antigénio pequeno é essencial para a replicação viral enquanto o antigénio grande é necessário para a formação de partículas infecciosas. Apesar da simplicidade do HDV este provoca um agravamento dos sintomas dos pacientes. Na primeira parte do trabalho pretendeu-se compreender as alterações provocadas pela replicação do HDV no proteoma das células. Verificou-se que a replicação do HDV provoca alterações no padrão de expressão de 43 proteínas celulares. Destas muitas encontram-se também diferencialmente expressas durante a replicação de outros vírus de hepatite como a chaperona molecular K, a proteína regulada pelo oxigénio 105kDa ou a ribonucleoproteína La. Também foram identificadas algumas proteínas relacionadas com a defesa da célula à infecção viral nomeadamente a copina I e a anfoterina. Posteriormente analisou-se as alterações no proteoma das células causadas pela expressão transiente de cada um dos constituintes do HDV. Observou-se alterações no padrão de expressão de 25 proteínas na presença do antigénio pequeno e do antigénio grande. Apesar do número de proteínas com o padrão de expressão alterado ser o mesmo os antigénios delta provocam alterações distintas na célula. O antigénio pequeno altera o padrão de expressão de várias proteínas relacionadas com o metabolismo dos ácidos nucleicos como a proteína 1 do complexo alfa, a proteína ribonuclear heterogénea L ou a proteína zinc finger 326. Enquanto a presença do antigénio grande provocava alterações em proteínas relacionadas com o transporte celular, como a proteína relacionada com o transporte de vesículas e com as vias energéticas. Quando as células expressam o RNA genómico apenas se observam alterações no padrão de expressão de 14 proteínas, a maioria delas envolvida em processos relacionados com o metabolismo celular, transporte enquanto que o RNA antigenómico provoca alterações no padrão de expressão de 23 proteínas relacionadas principalmente com o metabolismo de proteínas e com as vias energéticas. Os resultados obtidos por análise do proteoma foram validados por quantificação da expressão da lamina A/C e da ribonucleoproteína La na presença das RNPs virais por western blot. A validação dos resultados obtidos por 2DE para as proteínas: triosefosfato isomerase, proteína H1 de ligação às histonas, ribonucleoproteína nuclear heterogénea H, ribonucleoproteína nuclear heterogénea D e da proteína de choque térmico 105kDa foi efectuada por quantificação do mRNA utilizando qPCR. As proteínas diferencialmente expressas na presença das RNPs virais foram utilizadas na construção de uma rede de interacções proteína-proteína. Foram identificadas várias proteínas nesta rede, que interagem com as proteínas anteriormente identificadas, que estão envolvidas na replicação de vários vírus, nomeadamente a proteína c-myc, e no desenvolvimento de células cancerosas, nomeadamente a proteína 2 de ligação ao receptor do factor de crescimento. Na segunda parte deste trabalho pretendeu-se analisar a capacidade dos shRNAs em inibir a replicação do HDV. Para isso foram construídos vários vectores que expressam shRNAs dirigidos para os diferentes tipos de RNA do HDV. De seguida quantificou-se o número de células que exprimia os antigénios delta na presença dos shRNAs por imunofluorescência indirecta. Verificou-se que todas as sequências utilizadas eram capazes de diminuir o número de células que exprimia os antigénios delta em cerca de 70%. Posteriormente quantificou-se a expressão dos antigénios delta por western blot. Aqui os resultados foram bastante diferentes pois apenas as sequências que tinham como alvo o mRNA viral conseguiam diminuir os níveis de expressão dos antigénios delta. A diminuição dos níveis de expressão do antigénio pequeno chega a ser de 30% enquanto para o antigénio grande observou-se uma diminuição de 60%. Observou-se mesmo um aumento da expressão dos antigénios quando se utilizava shRNAs dirigidos para o RNA antigenómico. Finalmente, para tentarmos perceber a importância da sobreexpressão de algumas proteínas durante a presença do HDV na célula, analisou-se a capacidade do HDV em replicar em células que exprimiam shRNAs contra proteínas celulares. A expressão da lamina A/C, da ribonucleoproteína La, da chaperona molecular DNA K, da proteína regulada pelo oxigénio 150KDa, da chaperonina GroEL e da lamina B2 foi inibida. De seguida quantificou-se os níveis de mRNA do HDV nestas condições. Verificou-se que a inibição da expressão da lamina B2 provocava uma diminuição drástica nos níveis de mRNA do HDV enquanto a diminuição da expressão da lamina A/C provocava um ligeiro aumento nos níveis do mRNA viral. Analisou-se ainda a expressão dos antigénios delta por western blot. Aqui verificou-se que apenas a inibição da expressão da lamina B2 provocava uma diminuição da quantidade de antigénio pequeno presente na célula. No entanto, os níveis do antigénio grande diminuíam durante a inibição da expressão da ribonucleoproteína La, da chaperona molecular DNA K, da proteína regulada pelo oxigénio 150kDa e da chaperonina GroEL. Este trabalho constitui uma primeira abordagem na compreensão das alterações celulares causadas pela replicação do HDV. Permitindo a identificação de várias proteínas envolvidas em carcinomas ou na replicação de outros tipos de hepatite. Foram também identificadas várias proteínas celulares sobreexpressas durante a replicação do HDV que parecem desempenhar um papel importante no ciclo de replicação do vírus. Este trabalho possibilita o desenvolvimento de novas abordagens de modo a investigar e identificar novos alvos terapêuticos.

The hepatitis delta virus (HDV) is the only known human satellite virus and the only member of the floating genus Deltavirus. The replication of the HDV occurs independently of the replication of the helper virus, the hepatitis B virus (HBV), but to form infectious particles it needs the HBV surface proteins. Upon entering the nucleus the HDV single stranded, genomic RNA replicates by a rolling circle mechanism with the production of a complement strain of RNA, the antigenomic RNA. The HDV only encodes for one protein that exists in two forms, the small antigen and the large antigen. The delta antigens share most of their aminoacid sequence however they display different roles in the HDV life cycle. The small antigen is essential for viral replication whereas the large antigen in necessary for viral encapsidation. Despite its simplicity the HDV causes an increase in symptom severity. Thus, in this work we analysed the changes in the cellular proteome caused by the HDV replication. We identified 43 differentially expressed proteins in the presence of the HDV RNPs. Several of these proteins were involved in the replication of other viral hepatitis, namely the molecular chaperone DNA K, the oxygen regulated protein 150kDa and the ribonuclearprotein La. We also identified some proteins related to the cellular defence against viral infection such as the copine I protein and the anfoterin protein. After this primary analysis we also identified differentially expressed proteins in the presence of each of the HDV components. We observed 25 proteins with the expression pattern altered in the presence of the small antigen and the large antigen. Both antigens cause changes in the same number of proteins however these proteins have different functions in the cell. The small antigen causes changes in proteins related the nucleic acid metabolism like the alpha-complex protein 1, the heterogeneous ribonuclear particle protein L and the zinc finger protein 326. Whereas the large antigen causes changes in the expression pattern of proteins related with the cellular transport like the vesicle transport related protein and with the energy pathways of the cell. In the cells that expressed the genomic RNA we observed 14 differentially expressed proteins and we observed 23 differentially expressed proteins in the cells expressing the antigenomic RNA. These proteins were primary related with the protein metabolism and with the energy pathways of the cell. The results obtained by proteomic analysis were confirmed by quantification of the expression of the ribonuclearprotein La and the lamin A/C protein in the presence of the HDV RNPs by western blot. Whereas the results for the proteins: oxygen-regulated protein 150K, triosephosphate isomerase, heterogeneous nuclear ribonuclearprotein D, heterogeneous nuclear ribonucleoprotein H and histone H1-binding protein were confirmed by quantification of the mRNA by qPCR. We used the proteins differentially expressed in the presence of the viral RNPs to construct a protein-protein interactions network. We identified several proteins in this network that interacted with the previously identified proteins that are involved in the replication of several viruses, namely the c-myc protein, and in the development of cancer cells, namely the growth factor receptor-bound protein 2. The second part of this work aimed at analysing the ability of shRNAs in inhibiting the replication of the HDV. We constructed several vectors that expressed shRNAs targeting the different types of viral RNA. Then we analysed the number of cells expressing the viral proteins in the presence of the shRNAs by indirect immunofluorescence. All the sequences used were capable of decreasing the number of cells expressing the delta antigens in about 70%. Finally we quantified the expression of the delta antigens by western blot. Here we observed quite different results because only the sequences that targeted the viral mRNA were capable of inhibiting the expression level of the delta antigens. The small antigen was 30% repressed whereas the large antigen showed a 60% decrease in the expression levels. Interestingly we observed an increase in the levels of the delta antigens when we targeted the antigenomic RNA. Finally we analysed the changes in the viral replication in cells that expressed shRNAs against cellular proteins. In order to understand the importance of these overexpressed proteins, during the presence of the HDV, in the replication of the HDV. We inhibit the expression of these proteins: ribonuclearprotein La, lamin A/C, oxygen-regulated protein 150kDa, molecular chaperone DNA K, chaperonin GroEL and the lamin B2 protein. We then analysed the changes in the HDV mRNA level under these conditions. The results indicated a drastic decrease in the HDV mRNA level in the cells where the expression of the lamin B2 was decreased. Whereas, in the cells in which we repressed the expression of the lamin A/C we observed only a slight increase in the HDV mRNA level. We then analysed the changes in the expression of the HDV antigens by western blot. We observed a decrease in the expression levels of both the HDV antigens only when we repressed the expression of the lamin B2 protein. However the levels of the large antigen were found to be downregulated when we inhibit the expression of the ribonuclearprotein La, the molecular chaperone DNA K, the oxygen-regulated protein 150kDa and the chaperonin GroEL. This work constitutes a first approach to understand the cellular changes that occur during the HDV replication that might explain the increase in symptom severity in HDV infected patients. We identified several proteins involved in the replication of other hepatitis viruses and in the development of carcinoma. Several of the upregulated proteins appear to be important in the HDV replication cycle. Thus providing additional information to further investigate and identify novel therapeutic targets.