Interacção parasita-hospedeiro e susceptibilidade de Leishmania infantum a fármacos

Abstract

As leishmanioses são doenças causadas por um protozoário intracelular pertencente à ordem Kinetoplastida, da família Trypanosomatidae, do género Leishmania. Os parasitas são transmitidos aos hospedeiros vertebrados por dípteros pertencentes à sub-família Phlebotominae. Devido à inexistência de vacinas a quimioterapêutica continua a representar o único mecanismo de prevenção e controlo. Os fármacos de primeira linha para o tratamento da leishmaniose visceral continuam a ser os antimoniais pentavalentes e a anfotericina B (AMB). A AMB lipossómica está a ser cada vez mais utilizada como 1ª linha. O conhecimento do(s) mecanismo(s) utilizados pelos parasitas, responsáveis pela resistência, é fundamental de modo a permitir o desenvolvimento de novos fármacos anti-Leishmania que possam substituir e/ou complementar os fármacos existentes, de uma forma eficaz assim como contribuir para o desenvolvimento de metodologias para avaliar e monitorizar a resistência. Espera-se do modelo animal a reprodução da infecção na Natureza. Os modelos canino e murino têm ajudado na compreensão dos mecanismos responsáveis pela patogénese e pela resposta imunitária à infecção por Leishmania. Sendo o cão o principal hospedeiro da infecção por L. infantum e o principal reservatório doméstico da leishmaniose visceral humana, procedeu-se à caracterização da evolução da infecção experimental em canídeos de raça Beagle através da análise clínica, hematológica, histopatológica, parasitária, assim com através da resposta imunitária desenvolvida. As alterações hematológicas observadas foram as associadas à leishmaniose visceral: anemia, leucopenia, trombocitopenia com aumento das proteínas totais e da fracção gama-globulina, e diminuição da albumina. Histologicamente observou-se nos órgãos viscerais uma reacção inflamatória crónica, acompanhada por vezes da formação de granulomas ricos em macrófagos. Apesar de todos os animais terem ficado infectados (confirmado pela presença do parasita nos vários tecidos e órgãos recolhidos na necrópsia), os únicos sinais clínicos observados transitoriamente foram adenopatia e alopécia. As técnicas moleculares foram significativamente mais eficazes na detecção do parasita do que os métodos parasitológicos convencionais. As amostras não invasivas (sangue periféricoe conjuntiva) mostraram ser significativamente menos eficazes na detecção de leishmanias. No nosso modelo experimental não se observou a supressão da resposta celular ao antigénio parasitário e confirmou-se que, apesar de não protectora, a resposta humoral específica é pronunciada e precoce. A bipolarização da resposta imunitária Th1 ou Th2, amplamente descrita nas infecções experimentais por L. major no modelo murino, não foram observadas neste estudo. O facto dos animais não evidenciarem doença apesar do elevado parasitismo nos órgãos viscerais poderá estar relacionado com a expressão simultânea de citocinas de ambos os tipos Th1 e Treg, no baço, fígado, gânglio, medula óssea e sangue periférico. Neste estudo também se caracterizou o efeito da saliva do vector Phlebotomus perniciosus na infecção experimental de murganhos BALB/c com estirpes de L. infantum selvagem e tratada com AMB, inoculadas por via intradérmica. A visceralização da infecção ocorreu após a utilização da via de administração do inóculo que mais se assemelha ao que ocorre na Natureza. Apesar da disseminação dos parasitas nos animais co-inoculados com extracto de uma glândula salivar ter sido anterior à do grupo inoculado apenas com parasitas, não se detectaram diferenças significativas na carga parasitária, entre os três grupos, ao longo do período de observação pelo que, embora a saliva do vector esteja descrita como responsável pela exacerbação da infecção, tal não foi observado no nosso estudo. O aumento de expressão de citocinas esteve relacionado com o aumento do parasitismo mas, tal como no modelo canino, não se observou bipolarização da resposta imunitária. Os animais dos três grupos infectados parecem ter desenvolvido nos diferentes órgãos uma resposta mista dos tipos Th1 e Th2/Treg. Contudo, verificou-se a predominância da expressão Th1 (TNF-α), no fim do período de observação, o que pode estar relacionado com a resolução da infecção. Por outro lado, a presença de parasitas na pele dos animais inoculados com a estirpe L. infantum tratada com AMB permite colocar a hipótese da existência de parasitas resistentes na Natureza e destes poderem ser transmitidos. Após se ter verificado que a estirpe de L. infantum tratada com AMB tinha a capacidade de infectar e visceralizar no modelo murino, analisou-se o seu comportamento em dois dos principais vectores de L. infantum, Lutzomyia longipalpis e P. perniciosus. Os parasitas tratados com AMB apresentaram umamenor capacidade de permanecerem no interior do vector assim como um desenvolvimento mais lento apontando para uma menor capacidade de transmissão das estirpes resistentes a este fármaco, pelo que o tratamento com AMB poderá ser favorável à prevenção e controlo através da interrupção do ciclo de vida do parasita. De modo a determinar in vitro a susceptibilidade de Leishmania aos diferentes fármacos utilizados na terapêutica da leishmaniose humana e canina (Glucantime®, Fungizone®, miltefosine e alopurinol) comparou-se o sistema de promastigotas axénicos com o sistema amatigota-macrófago. Verificou-se que, para as estirpes estudadas, os resultados de ambos os sistemas não apresentavam diferenças significativas sendo a utilização do primeiro mais vantajosa ao ser menos moroso e de mais fácil execução. Seleccionaram-se estirpes quimio-resistentes in vitro, por exposição prolongada a doses crescentes de AMB, tendo-se verificado que os parasitas tratados, apresentaram uma menor susceptibilidade do que os não tratados à acção dos fármacos estudados, com excepção do alopurinol. A diminuição da susceptibilidade das estirpes aos fármacos utilizados poderá facilitar a dispersão de parasitas multiresistentes. Sendo a apoptose um dos mecanismos utilizados pelos parasitas para evitar a indução de uma resposta imune por acção de compostos anti- Leishmania, determinou-se o número de amastigotas apoptóticos assim como a produção de TNF-α e IL-10 pelos macrófagos tratados. Concluiu-se que os compostos conseguiram suprimir a produção de IL-10, inibidora da activação dos macrófagos, contudo nem a produção da citocina pro-inflamatória TNF- α nem a apoptose pareceram ser os principais mecanismos responsáveis à sobrevivência dos parasitas ao contacto com os fármacos.

Leishmaniasis is a parasitic disease caused by an intracellular protozoan belonging to the genus Leishmania and is transmitted between mammalian hosts by phlebotomine sand flies. Due to the inexistence of an effective vaccine, control and prevention relies mainly on chemotherapy. First-line drugs include pentavalent antimonials and amphotericin B (AMB) and its lipid formulation. A better understanding of resistance mechanism(s) would allow the development of new drugs which could substitute/complement the actions of the existing ones, as well the development of new diagnostics assays which could evaluate/monitor resistance. Animal models should mimic what happens in natural infection. The canine and murine models have proven useful in understanding the mechanisms of pathogenesis as well as the immunological response to Leishmania infection. Since dogs are the main domestic reservoir hosts of L. infantum infection, we followed-up an experimental leishmaniasis canine infection. Clinical, haematological, histophatological, parasitological as well as humoral and cellular immunological parameters were analysed. The main haematological alterations were the ones commonly associated with visceral leishmaniasis: anaemia, leucopenia, thrombocytopathy and total proteins increasing with hyperglobulinemia. Histopathological analysis revealed a chronic inflammatory reaction in visceral organs, in some cases associated with granulomas rich in macrophages. Although all animals were infected (confirmed by parasite detection in all tissues and organs at necropsy), transient lymphadenopathy and alopecia were the only clinical signs observed. Molecular techniques were significantly more efficient in detecting parasite compared to “classic” parasitological techniques. Non-invasive samples (peripheral blood and conjunctiva) were less efficacious to detect Leishmania. In our model there was no suppression of cellular immune response to specific parasite antigen and humoral response although precocious and intense, was non-protective. The Th1/Th2 bipolarised immune responses, thoroughly described in the murine model of L. major experimental infections, were not observed in our model. The lack of clinical signs, despite the high parasite load observed in visceral organs, could be associated with a mix Th1/Treg response in the different tissues/organs analysed.In this study we also analysed the effect of Phlebotomus perniciosus saliva in BALB/c mice intradermally infected with L. infantum wild type or with an AMB in vitro treated strain. The use of intradermal inoculation, which is closer to what happens in the natural course of infection due to transmission by the bite of a phlebotomine sand fly, allowed the visceralization of infection. Although mice coinoculated with saliva showed parasite dissemination precocity to the internal organs, no significant difference in the parasite load was observed between groups. Cytokine expression was related with an increase of parasite load, but as was the case in the canine model, no Th1/Th2 bipolarised immune response was observed. All infected mice developed a mixed immune response in different tissues, with concomitant production of Th1, Th2 and Treg cytokines. However, at the end of experiment, the Th1 pro-inflamatory cytokine TNF–α was the most expressed and could be related with resolution of infection and parasite clearance. On the other hand, the presence of AMB treated parasites in the skin of the animals allowed us to hypothesized that AMB resistant strains could arise and be transmitted in Nature as a result of increased clinical used of AMB therapy . After confirming that L. infantum AMB-treated parasites could infect and visceralize in the murine model, we analysed its capacity to develop in the two main L. infantum vectors, Lutzomyia longipalpis and P. perniciosus. Despite the low infection rate, promastigotes of AMB-treated strain were able to develop late-stage infections in the midgut of both sand flies species tested. Although more studies are needed to determine the vectorial capacity of sand flies to transmit AMB-resistant parasites, it seems that they have a lower capacity to be transmitted, so intentional selection of AMB-resistant parasites could be used in addition to control and prevent Leishmania transmission. Axenic promastigotes and intracellular assays were compared in order to determine in vitro Leishmania susceptibility to the main drugs used in human and canine therapy in Portugal (Glucantime®, Fungizone®, miltefosine and allopurinol). Since no significant differences were observed between both assays, axenic promastigotes assays are easier to perform and less time-consuming. AMB treated parasites were obtained by subculturing promastigotes in media containing increasing concentrationsof this drug. AMB treated parasites were less susceptible than WT to Glucantime®, Fungizone® and miltefosine, except to allopurinol. The decreased susceptibility to the drugs currently used in chemotherapy could facilitate the spreading of multiresistant strains. Since most of anti-Leishmania drugs´action depends on host´s immune response and as parasites use apoptosis as one of the mechanism to avoid it, we determined the number of apoptotic amastigotes as well as TNF-α and IL-10 production by infected and treated macrophages. It was verified a decreased IL-10 production by macrophages after drug treatment but neither TNF-α or apoptosis seemed to be the main mechanisms responsible for parasites’ survival after treatment.