Identificação e caracterização filogenética preliminar de poliomavírus de origem animal

Abstract

Os poliomavírus representam uma família de pequenos vírus nus, de simetria icosaédrica e de genoma de ácido desoxirribonucleico (DNA), encontrados numa vasta gama de hospedeiros (peixes, aves e mamíferos, incluindo o Homem), a qual tem vindo muito recentemente a ser alargada. O seu nome deriva das palavras gregas poly, que significa “muito”, e oma, que representa “tumor”, uma vez que alguns membros da família possuem a capacidade de induzir múltiplos tumores em animais infetados experimentalmente. Neste âmbito, estes vírus têm sido associados, em maior ou menor escala, a doença humana, incluindo, de um modo inequívoco, a uma forma rara de cancro da pele, o carcinoma das células de Merkel. Neste estudo, procurou-se identificar, caracterizar filogeneticamente, ainda que de modo preliminar, e, eventualmente, isolar in vitro, os poliomavírus de amostras fecais de origem animal. Para tal, 163 amostras fecais foram estudadas, correspondentes a 144 de primatas não-humanos do Jardim Zoológico de Lisboa (ZLX) (incluindo 36 espécies, de sete famílias distintas, cobrindo todos os grandes grupos taxonómicos de primatas), 15 de morcegos com origem nos concelhos de Almada e Montemor-o-Novo, três de rato-doméstico (Mus sp.) e uma de musaranho-de-dentes-brancos, estas últimas também provenientes do ZLX, tendo como ponto de partida a amplificação de uma região de cerca de 260 pb, codificante da proteína da cápside VP1, no DNA genómico dos poliomavírus, por nested PCR, com recurso a primers universais degenerados. Todas as suspensões fecais produzidas foram inoculadas em linhas celulares contínuas (células Vero E6 e A549), para tentativa de isolamento viral. A identidade das espécies hospedeiras com amostras positivas foi confirmada por análise da sequência nucleotídica parcial do gene mitocondrial do citocromo b. Foi detetado DNA de poliomavírus em 17 amostras (10,4%), 15 com origem em primatas não-humanos (macaco-fidalguinho, mico-leão-dourado, saimiri-da-bolívia, babuíno-hamadrias e chimpanzé-comum), incluindo espécies de macacos do Novo Mundo, do Velho Mundo e grandes símios, e duas em morcegos-de-ferradura-pequenos. No entanto, não foi possível isolar os vírus em questão em culturas celulares. Pela análise das relações filogenéticas estabelecidas, foi possível determinar que duas das sequências nucleotídicas obtidas, resultantes das amostras fecais de mico-leão dourado e babuíno-hamadrias, apresentaram natureza inesperada, ou seja, elevada identidade com poliomavírus de roedores, e que para outras quatro (de saimiri-dabolívia, macaco-fidalguinho e as duas de morcego-de-ferradura-pequeno) seria relevante obter um segmento nucleotídico de maior tamanho/genoma completo, pois aparentam ser de poliomavírus ainda não descritos na literatura ou sem o genoma completo depositado nas bases de dados internacionais. Foi ainda detetada a circulação de dois poliomavírus filogeneticamente distintos na colónia de saimiris-da-bolívia e uma elevada taxa de infeção presuntiva no grupo de chimpanzés-comum. Dado que existe uma relação filogenética próxima entre poliomavírus de morcegos e de primatas não-humanos e que estes últimos apresentam grande proximidade evolutiva com o Homem, é de especial interesse avaliar a possibilidade da transmissão zoonótica destes vírus para a espécie humana, com recurso a estudos de carácter filogenético.

Polyomaviruses represent a family of small, nonenveloped, icosahedral and deoxyribonucleic acid (DNA) genome viruses found in a broad range of animal hosts (fish, birds and mammals, including humans), which has recently been expanded. Its name derives from the Greek words poly, meaning "many", and oma, denoting "tumour", since some members of the family Polyomaviridae have the ability to induce multiple tumours in experimentally infected animals. In this context, these viruses have also been associated, to a greater or lesser extent, to human disease, including, unquestionably, to a rare form of skin cancer, Merkel cell carcinoma. In this study, it was sought to identify, to characterize phylogenetically, albeit preliminary, and to isolate in vitro, the polyomaviruses from faecal samples of animal origin. To that end, 163 faecal samples were screened, corresponding to 144 non-human primates from the Lisbon Zoo (ZLX) (including 36 species from seven distinct families, covering all major taxonomic groups of primates), 15 bats originating from the municipalities of Almada and Montemor-o-Novo, three house mice (Mus sp.) and one greater white-toothed shrew, the latter also originating from the ZLX, having as a starting point the amplification of a region of about 260 bp, encoding the VP1 capsid protein in the polyomavirus genomic DNA, by nested PCR, using degenerate universal primers. All faecal suspensions produced were inoculated into continuous cell lines (Vero E6 and A549 cells) for attempted viral isolation. The identity of each of the host species that produced a positive faecal sample was confirmed by analysis of the partial DNA sequence of the cytochrome b mitochondrial gene. Polyomavirus DNA was detected in 17 samples (10.4%), 15 originating from non-human primates (brown capuchin, golden lion tamarin, Bolivian squirrel monkey, hamadryas baboon and common chimpanzee), including species of New World monkeys, Old World monkeys and great apes, and two from lesser horseshoe bats. However, it was not possible to isolate the viruses in cell cultures. By analysing the established phylogenetic relationships, it was possible to determine that two of the obtained nucleotide sequences, amplified from faecal samples of the golden lion tamarin and the hamadryas baboon, were somehow unexpected, presenting high identity with rodent polyomaviruses, and that for other four (from the Bolivian squirrel monkey, the brown capuchin and two lesser horseshoe bats) would be relevant to obtain a larger nucleotide segment/complete genome, as they appear to correspond to polyomaviruses not yet described in the literature or without the complete genome in international databases. Circulation of two phylogenetically distinct polyomaviruses in the Bolivian squirrel monkey enclosure and a high rate of putative infection in the common chimpanzee troop were also detected. Given that there is a close phylogenetic relationship between bat and non-human primate polyomaviruses and the high evolutionary proximity of the latter hosts to humans, it is of particular interest to evaluate the possibility of zoonotic transmission of these viruses to our species by phylogenetic studies.