Modulação da microbiota intestinal de Anopheles stephensi, quantificação bacteriana e avaliação do efeito na infeção por Plasmodium berghei

Abstract

A malária é um problema de saúde global, que afeta as populações mais carenciadas. Segundo World malaria report 2023 da Organização Mundial de Saúde (OMS), em 2022 identificaram-se 249 milhões de casos de malária e 608.000 mortes. O aumento das taxas de incidência e mortalidade, surgem num período estacionário e após a interrupção dos serviços de controle da malária durante a pandemia de COVID-19. Os eventos climáticos extremos, conflitos e crises humanitárias, restrições de recursos, ameaças biológicas e desigualdades dificultaram a recuperação. Maioritariamente, a malária é prevenível pelo controlo vetorial, com distribuição em larga escala de redes mosquiteiras impregnadas com inseticidas e pulverização-intradomicilaria. Contudo, há uma crescente resistência dos vetores aos inseticidas, levando ao aumento da carga da doença. De acordo, com o Mapa de Ameaças à Malária, da OMS, existem ainda outras ameaças ao controlo e eliminação da malária, como: deleções do gene pfhrp2/3, resistência aos medicamentos antimaláricos e o surgimento de espécies de vetores invasores com grande capacidade de adaptação e sobrevivência em diversos habitats, como Anopheles stephensi em Africa. A microbiota intestinal dos insetos tem impacto na nutrição, proteção contra os parasitas e agentes patogénicos, modulação das respostas imunes, crescimento, desenvolvimento, sobrevivência e competência vetorial. Estudos anteriores, caracterizaram a diversidade bacteriana do intestino médio em espécies de Anopheles com métodos dependentes e independentes de cultura e demonstraram a capacidade das bactérias influenciarem negativamente o desenvolvimento de Plasmodium dentro dos mosquitos. Mosquitos fêmeas An. stephensi foram tratados com antibióticos e confirmada a redução bacteriana através da quantificação do número de colónias em meios de cultura (colony forming units (CFU)). Como se trata de uma técnica morosa, pretendeu-se otimizar uma técnica alternativa à cultura, o PCR quantitativo em tempo real (qPCR) com genes alvo microbianos universais como o RNA ribossomal 16S (16SrRNA). Colonizou-se os mosquitos com a bactéria Pseudomonas mendocina (estirpe isolada do intestino médio de Anopheles gambiae do insectário do IHMT), e avaliou-se o seu efeito na infeção com o parasita Plasmodium berghei. Foram desenhados e sintetizados primers e sondas específicos para P. mendocina usando como gene alvo o homologo do gene mucA de Pseudomonas aeruginosa, para confirmação bacteriana por Polymerase Chain Reaction (PCR). Após tratamento com antibióticos a microbiota intestinal do mosquito ficou significativamente reduzida (P˂0,05, Mann-Whitney). A microbiota tratada com antibióticos foi eliminada quase na totalidade. O controlo vetorial simbiótico na malária, é uma alternativa com interesse de estudo, tendo em conta as crescentes ameaças ao seu controlo e eliminação.

Abstract Malaria is a global health problem, which affects the lowest income populations. According to the World Malaria Report 2023 from the World Health Organization (WHO), 249 million cases of malaria and 608,000 deaths were reported in 2022. The increase in incidence and mortality rates arises after the interruption of malaria control activities during the COVID-19 pandemic. Extreme weather events, conflicts and humanitarian crises, resource constraints, biological threats and inequities have hampered recovery. Malaria is preventable through vector control, with large-scale distribution of insecticide-treated bed nets and residual indoor spraying. However, there is a growing resistance of vectors to insecticides, leading to higher disease burden. According to the WHO Malaria Threat Map, additionally the control and elimination of malaria are threatened by factors such as: deletions of the pfhrp2/3 gene, resistance to antimalarial drugs and the emergence of invasive vector species with great capacity to adapt and survive in diverse habitats, such as Anopheles stephensi in Africa. The intestinal microbiota of insects has an impact on nutrition, protection against pathogens, modulation of immune responses, growth, development, survival and vector competence. Previous studies have characterized midgut bacterial diversity in Anopheles species with culture-dependent and culture-independent methods and demonstrated the ability of bacteria to negatively influence Plasmodium development within mosquitoes. Female An. stephensi were treated with antibiotics and bacterial reduction was confirmed by quantifying the number of colonies in culture media (colony forming units (CFU)). As it is a time-consuming technique, the optimization of an alternative technique to culture, was pursued. Real-time quantitative PCR (qPCR) with universal microbial target genes such as 16S ribosomal RNA (16SrRNA). The mosquitoes were colonized with the bacterium Pseudomonas mendocina (strain isolated from the midgut of Anopheles gambiae from the IHMT insectary), and the effect on Plasmodium berghei infection evaluated. Specific primers and probes for P. mendocina were designed and synthesized using as target the gene homologue to mucA gene from Pseudomonas aeruginosa, for bacterial confirmation and quantification by qPCR. After treatment with antibiotics, the mosquito's intestinal flora was significantly reduced (P˂0.05, Mann-Whitney). The microbiota treated with antibiotics was almost eliminated. Symbiotic vector control in malaria is an alternative to malaria control, given the growing threats to its control and elimination.