Contributo para a caraterização molecular do vírus da hepatite B (HBV) em circulação em duas províncias de Angola

Abstract

RESUMO Introdução: Angola é um país da África subsaariana onde circula o vírus da hepatite B (HBV), um vírus de DNA hepatotrópico, carcinogénico e endémico na população, tendo esta uma situação vacinal anti-HBV desconhecida. Objetivo: Caraterizar o perfil molecular de um segmento da região de sobreposição dos genes S/P do HBV presente em amostras de plasma provenientes de utentes atendidos em duas Unidades de Saúde das cidades do Lubango e de Benguela. Material e Métodos: Selecionaram-se 512 amostras de plasma com teste rápido (HBsAg+ e HBsAg-), previamente criopreservadas, das quais se tinha informação de natureza sociodemográfica e laboratorial disponível em bases de dados, sendo 456 provenientes de parturientes (Grupo 1) e 56 de doentes hospitalares (Grupo 2), de acordo com os locais de origem mencionados. Procedeu-se à extração de DNA viral com um kit comercial, seguindo-se a amplificação do DNA do HBV por nested-PCR para obtenção de um amplicão com 340 pb, aproximadamente. Após sequenciação direta unidirecional de Sanger validaram-se 103 cromatogramas que foram editados. As respetivas sequências foram alinhadas no programa informático BioEdit V.7.2.5. e a sua identidade confirmada através do programa https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi. A tradução proteica das regiões codificantes da transcriptase reversa e do HBsAg foi realizada com o programa https://hbv.geno2pheno.org/index.php para análise das mutações. Resultados: No Grupo 1 obteve-se 12,3% (56/456) de casos de infeção pelo HBV, sendo 8,3% (38/456) identificados previamente com HBsAg+ e 4,3% (18/418) detetados com infeção oculta (HBsAg-/DNA-HBV+). A taxa global de amplificação de DNA do HBV foi de 11,2% (51/456), com 100% (51/51) das parturientes infetada pelo genótipo E, com subtipo ayw4 (97,0%) e ayw1 (3,0%). Cerca de 92,2% dos vírus (47/51) continha mutações pontuais (32/33 HBsAg+ vs 15/18 HBsAg-/DNA+). No Grupo 2, obtiveram-se 52/56 sequências HBV, 98,1% (51/52) de genótipo E e 1,9% (1/52) de genótipo A, subgenótipo 2, subtipo adw2. Entre os portadores do genótipo E, 100% (23/23) dos doentes com HBsAg+ tinham vírus do subtipo ayw4. Entre os casos de infeção oculta (28/28), 57,1% eram ayw1, 39,3% ayw4 e 3,6% de subtipo indeterminado. Mutações pontuais ocorreram em 100% das sequências do Grupo 2. Mutações de provável resistência ao tratamento com análogos nucleosídeos/nucleotídeos foram detetadas no Grupo 1 em três portadoras HBsAg+ com variantes de resistência putativa à Lamivudina (rtT128N; rtN139D e rtV207L). Nas portadoras HBsAg-/DNA+, detetou-se um caso com dupla resistência (primária_rtA194T/Tenofovir + putativa_rtV207L/Lamivudina). No Grupo 2 ocorreram quatro casos, um no genótipo A, resistente a Lamivudina + Adefovir (putativa_W153R), e três casos entre os doentes com HBsAg-/DNA+, um resistente ao Entecavir ou Adefovir (primária_rtI169L) e dois resistentes a Lamivudina (putativa_rtT128N). Variantes de escape (imunitário, diagnóstico e vacinal) surgiram no Grupo 1 (sP120T; sQ129H, sD144E) e no Grupo 2 (sP120T, sT126I; sQ129R; sG130R; sD144A; sD144E e sG145K). Conclusão: Esta pesquisa, realizada em zona de elevada endemicidade, reforça que o genótipo E predomina em Angola com dois subtipos virais (ayw4 e ayw1). Variantes de resistência ao tratamento com antivirais e mutantes de escape também foram identificados nesta população que é virgem de tratamento, com situação vacinal anti-HBV pouco esclarecida.

ABSTRACT Introduction: Angola is a country in the sub-Saharan of Africa where the hepatitis B virus (HBV), a hepatotropic, carcinogenic and endemic DNA virus circulates in the population, with an unknown anti-HBV vaccination status. Objective: To characterize the molecular profile of a segment of the HBV S/P gene overlapping this region present in plasma samples from users treated in two Health Units in the cities of Lubango and Benguela. Material and Methods: 512 plasma samples were selected (HBsAg+ and HBsAg-), previously cryopreserved, sociodemographic and laboratory information was available in the databases, 456 coming from parturient women (Group 1) and 56 samples from patients hospitals (Group 2), according to the mentioned places of origin. Viral DNA was extracted using a commercial kit, followed by amplification of HBV DNA by nested-PCR to obtain an amplicon measuring approximately 340 bp. After direct unidirectional Sanger sequencing, 103 chromatograms were validated and edited. The respective sequences were aligned using the BioEdit V.7.2.5 software program. and your identity confirmed through the program https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi. Protein translation of the coding regions for reverse transcriptase and HBsAg was performed using the program https://hbv.geno2pheno.org/index.php for mutation analysis. Results: In Group 1, 12.3% (56/456) of cases the HBV infection were found, as present with 8.3% (38/456) previously identified with HBsAg+ and 4.3% (18/418) detected with occult infection (HBsAg-/DNA-HBV+). The overall rate of HBV DNA amplification was 11.2% (51/456), with 100% (51/51) of parturients infected by genotype E, with subtype ayw4 (97.0%) and ayw1 (3, 0%). About 92.2% of viruses (47/51) contained point mutations (32/33 HBsAg+ vs 15/18 HBsAg-/DNA+). In Group 2, 52/56 HBV sequences was present 98.1% (51/52) of genotype E and 1.9% (1/52) of genotype A, subgenotype 2, subtype adw2. Among genotype E carriers, 100% (23/23) of patients with HBsAg+ had viruses of the ayw4 subtype. Among cases of occult infection (28/28), 57.1% were ayw1, 39.3% ayw4 and 3.6% of undetermined subtype. Point mutations occurred in 100% of the sequences in Group 2. Mutations of probable resistance to treatment with nucleoside/nucleotide analogues were detected in Group 1 in three HBsAg+ carriers with putative resistance variants to Lamivudine (rtT128N; rtN139D and rtV207L). In HBsAg-/DNA+ carriers, one case with double resistance was detected (primary_rtA194T/Tenofovir + putative_rtV207L/Lamivudine). In Group 2 there were four cases, one in genotype A, resistant to Lamivudine + Adefovir (putative_W153R), and three cases among patients with HBsAg-/DNA+, one resistant to Entecavir or Adefovir (primary_rtI169L) and two resistant to Lamivudine (putative_rtT128N). Escape variants (immune, diagnostic and vaccine) emerged in Group 1 (sP120T; sQ129H, sD144E) and in Group 2 (sP120T, sT126I; sQ129R; sG130R; sD144A; sD144E and sG145K). Conclusion: This research, carried out in a high endemicity area, reinforces that genotype E predominates in these regions of Angola, with two viral subtypes (ayw4 and ayw1). Variants resistant to treatment with antivirals and escape mutants were also identified in this untreatmented population, with an unclear anti-HBV vaccination status.