Lymnaea truncatula em Portugal: contribuição para o estudo da bioecologia e da variação genética

Abstract

Lymnaea truncatula é um gastrópode de água doce com importância em medicina por ser hospedeiro intermediário do tremátode parasita Fasciola hepatica. É o único hospedeiro intermediário desta espécie encontrado até agora em Portugal. A fasciolose é responsável por perdas de produtividade em gado. Nos humanos, é uma parasitose emergente com relevo em saúde pública em várias regiões do globo. Portugal é o segundo país europeu com maior prevalência. L. truncatula é de difícil controlo por ser anfíbia e ter boa capacidade de sobrevivência e adaptação. A eficácia dos programas de controlo e monitorização depende da correcta identificação das espécies de hospedeiros intermediários, dado que nem todas as espécies apresentam a mesma sensibilidade à infecção por F. hepatica. A morfologia da concha e a anatomia dos órgãos são insuficientes na identificação das espécies, sendo necessário usar técnicas de biologia molecular. Os objectivos deste estudo foram: estudar a distribuição, a variação da densidade populacional ao longo do ano, a diversidade genética, os habitats e a influência de parâmetros físicos, químicos e biológicos, na densidade populacional de L. truncatula em cinco distritos portugueses (Coimbra, Évora, Leiria, Lisboa e Funchal). Realizaram-se inquéritos malacológicos bimestrais durante 2 anos, entre Janeiro de 2006 e Dezembro de 2007 em Portugal continental e dois (Julho e Novembro de 2009) na ilha da Madeira. No continente, encontrou-se L. truncatula em: ribeiros temporários, com pouca vegetação, substrato de argila e matéria em decomposição e com água límpida, incolor e inodora, e com concentração de cálcio e de sulfatos até 50 mg/l e 267mg/l, respectivamente. A presença de outras espécies de moluscos, como Planorbarius metidjensis, Lymnaea peregra e da subclasse Prosobronchiata, assim como concentrações elevadas de nitratos, estão associados a uma menor densidade populacional. Na ilha da Madeira, os habitats foram predominantemente: escorrimentos de encosta, permanentes, com fraca exposição solar, pouca vegetação, substrato de rocha, argila e matéria em decomposição e com água límpida, incolor e inodora, acima dos 14,4ºC. A densidade populacional diminui com o aumento dos valores de nitratos e aumenta com a concentração de cálcio na água. As fezes de animais presentes junto às colecções de água não apresentaram ovos de F. hepatica. Foi encontrado um exemplar de F. hepatica no fígado de um gamo da Tapada Nacional de Mafra (distrito de Lisboa) Estudou-se a diversidade genética de L. truncatula através de RAPD-PCR e sequenciação do gene ribossomal 18S e da região ITS-2 (este também por PCR-RFLP). Identificou-se pela primeira vez em Portugal continental e na ilha da Madeira uma espécie, geneticamente diferente mas morfologicamente muito semelhante a L. truncatula – Lymnaea schirazensis. Na ilha da Madeira, foi detectado um haplotipo distinto do presente no continente. O marcador de RAPD - OPA2 e PCR-RFLP com HpaII, são bons marcadores para distinção entre L. truncatula e L. s schirazensis. Adicionalmente, detectou-se pela primeira vez na ilha da Madeira L. (Pseudosuccinea) columella, conhecido hospedeiro intermediário de F. hepatica. Este estudo permitiu melhorar o conhecimento sobre hospedeiros intermediários de F. hepatica em Portugal, o que poderá melhorar o controlo e monitorização da fasciolose.

Lymnaea truncatula is a freshwater snail with medical and veterinary interest, due to its role as an intermediate host of the liver fluke Fasciola hepatica, and the only one found in Portugal. The productivity losses are the main effects of fascioliasis in animals. In humans, fascioliasis is an important emerging disease, from the public health view, in several regions. Portugal is the second most prevalent country in Europe. The L. truncatula control programs are difficult due to this snail amphibian characteristic, the survival capacity and adaptation to the environmental conditions. The efficiency of these control and monitoring programs depends on the correct identification of the snail intermediate hosts species, due to the different susceptibility rates to F. hepatica infection. The shell morphology and tissue anatomy are not sufficient to the species taxonomic identification, therefore the use of molecular tools is necessary. The objectives of this study were: to study the distribution and population density of L. truncatula throughout the year; the genetic diversity, habitats and the influence of the physical, physico-chemical and biological parameters, on the population density of L. truncatula in five Portuguese districts (Coimbra, Évora, Leiria, Lisbon and Funchal). Malacological surveys were performed every two months for two years, between January 2006 and December 2007, in mainland Portugal and two surveys (July and November 2009) in Madeira island. In the mainland L. truncatula was found in temporary small rivers, with low vegetation, mud and decomposing organic matter substratum, with clear water. The suitable calcium and sulfate concentrations were up to 50 mg/l and 267mg/l respectively. Other freshwater snails species like Planorbarius metidjensis, Lymnaea peregra and Prosobronchiata sub-class, as well as higher nitrate concentrations seem to be associated with a lower L. truncatula population density. In Madeira island, the habitats were mainly permanent runoff slopes, with low sun exposure, low vegetation, rocks, mud and decomposing organic matter substratum, with clear water over 14,4ºC. The population density decreased with the increase of nitrate levels in water. There were not found F. hepatica eggs in animal faeces, near the water courses. One F. hepatica parasite was recovered from a liver of a deer from Tapada Nacional de Mafra (Lisbon district) Genetic diversity of L. truncatula was studied through RAPD-PCR, ribosome 18S and ITS-2 sequencing and PCR-RFLP applied to the ITS-2 region.For the first time, in Portugal (mainland and Madeira island), it was identified a genetically different species, with morphological similarities to L. truncatula – Lymnaea schirazensis. In Madeira island, a distinct haplotype of this species was found. The RAPD-PCR - OPA2 marker and PCR-RFLP (with HpaII enzime), showed to be suitable markers for differentiation between L. truncatula and L. schirazensis. Furthermore, it was detected, for the first time, the snail L. (Pseudosuccinea) columella, in Madeira island, a natural intermediate host of F. hepatica in several regions. This study allowed us to improve the knowledge of F. hepatica intermediate hosts in Portugal, which will allow a better control and monitoring of fascioliasis.