The role of α-Gal (Galα1-3Galβ1-4GlcNAc-R) on Plasmodium spp. sporozoites in Anopheles spp. mosquito salivary glands invasion

Abstract

Introdução: Compreender a interação entre Plasmodium e o mosquito Anopheles é crucial para o desenvolvimento de estratégias de controlo e eliminação da malária em áreas endêmicas. A invasão das glândulas salivares do mosquito vetor é uma das etapas mais importantes para a transmissão da malária. Compreender como Plasmodium interage com esse órgão é fundamental para o controle e eliminação da malária. Muitos glicanos estão implicados na interação célula-célula e podem desempenhar um papel central na interação do parasita com o hospedeiro. O glicano Galα1-3Galβ1-4GlcNAc-R ou simplesmente α-Gal é um antígeno importante para o sistema imunológico humano e está presente no Plasmodium. Objetivos: Neste trabalho pretendemos compreender o papel da α-Gal durante a invasão das glândulas salivares de Anopheles spp. e estabelecer a origem da α-Gal presente no Plasmodium. Métodos: Para deteção da α-Gal usou-se a técnica de microscopia de imunofluorescência em esporozoítos de Plasmodium bergei ANKA-GFP (SPZs), oocineto e oócitos, fixados com paraformaldeído a 4% e incubados com o mAbs anti-α-Gal_IgG2b e o secundários IgG anti-rato conjugado com Alexa fluor- 647, com mAbs anti-CSP conjugado com Alexa fluor-647 ou com a Isolectina BSI-IB4 conjugado com o fluoróforo Alexa fluor-647. O antígeno α-Gal foi detectado no intestino médio (MGs) e nas glândulas salivares (SGs) dos mosquitos por microscopia de imunofluorescência e Western Blots. Esporozoítos (SPZs) expressando α-Gal, coletados do MGs (8º aos 23º dias pós-infeção), hemolinfa (14º ao 23º dpi) e SGs (14º ao 23º dpi) de An. Stephensi, foram detetados e quantificados por citometria de fluxo. A expressão do gene UDP-GalT em SPZs obtidos a partir de MGs e SGs, de diferentes dias pós-infeção, foi quantificada por RT-qPCR e comparado usando o método 2-ΔΔct. O papel de α-Gal na interação Plasmodium e as glândulas salivares foi investigado. Os genes do UDP-GalT e das lecitinas do tipo C (CTL) do mosquito foram silenciados usando o método RNA de interferência. RNA(s) de fita dupla específico foi injetado em mosquitos com 8º dia após-infeção. O silenciamento dos genes foi confirmado por RT-qPCR e no 18º dpi as SGs e as MGs foram dissecados e os SPZs quantificados usando o hemocitómetro. O número de SPZs foi comparado com os grupos controle injetados com dsRNA não relacionado. A presença de α-Gal no ensaio de gliding dos SPZs foi investigado usando mAbs anti-α-Gal conjugados com Alexa fluor-647. Além disso, o efeito de mAbs anti-α-Gal e Leciona BSI-IB4 no movimento de glinding dos SPZs foi testado usando microscópica. Resultados: A presença de α-Gal foi detetada por microscopia de imunofluorescência no intestino médio e nas glândulas salivares do mosquito e em esporozoítos e oocinetes de Plasmodium. A percentagem de SPZs que expressaram α-Gal em citometria de fluxo em diferentes dias pós-infeção, não apresentaram diferença significativa entre esses, mas quando SPZs de diferentes origens (SGs, HL e MGs) foram comparados, os SPZs das SGs apresentaram expressão significativamente mais elevada de α-Gal. O número de SPZs de SGs foi reduzido quando o gene UDP-GalT dos mosquitos foi silenciado, enquanto nenhuma diferença foi observada no número de SPZs das MGs, mas uma percentagem reduzida de SPZs expressando α-Gal e menor intensidade de α-Gal foi observada nas provenientes das MGs, mas não nas SG. Dos três genes alvo da lectina do tipo C (CTL)-galactose silenciados com dsRNA, apenas um foi silenciado com sucesso. O silenciamento do gene de ligação à lectina do tipo C (CTL) -galactose resultou em uma redução significativa da invasão de SGs pelos Plasmódios quando comparado ao controlo. No entanto, um incremento na expressão de α-Gal foi observado nesses SPZs. α-Gal não pôde ser detetado no ensaio de glinding dos SPZs e nenhum efeito no movimento dos SPZs foi observado quando encubados com mAbs anti-α-Gal ou lectina BSI-IB4. Conclusão: O antígeno α-Gal está presente em todo o ciclo esporogónio do Plasmodium, apresentando uma origem não exclusiva dos mosquitos. Os dados sugerem que α-Gal está envolvida na invasão da glândula salivar dos mosquitos, possível por meio da interação do recetor, mas não por processo de glinding.

Introduction: Understanding Plasmodium and mosquito vector interactions is crucial to develop strategies for control and malaria elimination in endemic areas. Mosquito’s salivary glands invasion is one of the most important steps for malaria transmission. Understanding how the Plasmodium parasite interacts with this organ is fundamental to achieve malaria elimination. Many glycans are implicated in cell-to-cell interactions and could play a central role in parasite-host interactions. The Galα1-3Galβ1-4GlcNAc-R glycan or simply α-Gal epitope is a major antigen for the human immunologic system and its present on Plasmodium, the malaria parasite. Aims: In this work, we aimed to understand the role of α-Gal during Anopheles spp. salivary glands invasion by Plasmodium and to establish the origin of Plasmodium α-Gal. Methods: To detect α-Gal immunofluorescence was used, Plasmodium bergei ANKA-GFP sporozoites (SPZs), ookinetes, and oocytes were fixed with 4% paraformaldehyde and stained with the anti-α-Gal_IgG2b with secondary anti-mouse IgG conjugated with Alexa fluor-647, anti-CSP mAbs conjugated with Alexa fluor-647, or with Isolectin BSI-IB4 conjugated with Alexa fluor-647. The α-Gal antigen was detected on mosquitoes’ midgut (MG) and salivary glands (SGs) by immunofluorescence microscopy and western blots. SPZs expressing α-Gal from infected An. stephensi collected from MG (8th to the 23rd days post-infection), hemolymph (14th to the 23rd dpi), and SGs (14th to the 23rddpi) were detected and quantified using flow cytometry. The Plasmodium UDP-Gal transporter gene expression in SPZs from the MGs and SGs was accessed by RT-qPCR and the 2-ΔΔct at different days post-infection. The role of α-Gal on the Plasmodium mosquito interactions was investigated. Mosquitoes` UDP-Gal transporter and C-Type lectins (CTL)-galactose-binding genes were targets using RNA interference. The specific double-stranded RNA was injected on the 8th day post-infection. Gene silence was confirmed using RT-qPCR and at the 18th dpi, SGs and MGs were dissected and SPZs quantified by haemocytometer. The number of SPZs were compared with the control groups injected with unrelated dsRNA. The presence of α-Gal on SPZ gliding trial was investigated using anti-α-Gal mAbs conjugated with Alexa fluor-647. Additionally, the effect of anti-α-Gal mAbs and Isolectin BSI-IB4 on SPZs gliding movement was tested using live microscopic images. Results: The presence of α-Gal was detected by immunofluorescence microscopy in the mosquito’s midguts and salivary glands and on Plasmodium sporozoites and ookinetes. The percentage of SPZs expressing α-Gal, by flow cytometry at different days post-infection showed a non-significant difference between them, but when SPZ from different organs (SG, HL, and MG) were compared, the SPZs from SGs presented significantly higher expression of α-Gal. The number of SPZs from SGs was reduced when mosquitoes UDP-Gal transporter gene was silenced while no differences were observed on the number SPZs from MG, but a reduced percentage of SPZs expressing α-Gal and lower α-Gal intensity was observed in MG but not SG. From the three C-Types lectins (CTL)-galactose-binding gene target with dsRNA, only one was successfully silenced. The silencing of the C-Types lectin (CTL)-galactose-binding gene resulted in a significant reduction of SGs invasion when compared with the control. However, an increment in α-Gal expression was observed on those SPZs. α-Gal could not be detected on SPZs gliding trial and non-effect on SPZs movement were observed when SPZs were incubated with anti-α-Gal mAbs or Isolectin BSI-IB4. Conclusion: The α-Gal antigen is present throughout the Plasmodium sporogonic cycle, presenting a non-mosquito exclusive origin. The data suggest that α-Gal is involved in mosquito salivary gland invasion possible via receptor interaction but not via gliding.