Strategies to prevent the timely sub-cellular localization of the capsule synthetic machinery in Streptococcus pneumoniae

Abstract

A capacidade de Streptococcus pneumoniae em causar doença está normalmente dependente da presença do polissacárido capsular, também denominado de cápsula, no exterior da superfície deste organismo bacteriano. Assim, o estudo do processo que regula e realiza a síntese deste polímero é fundamental para o desenvolvimento de novas estratégias que possam ser empregues no combate a este agente patogénico humano. De forma a estudar como ocorre a coordenação da síntese da cápsula durante o ciclo celular bacteriano, tornou-se necessário o desenvolvimento de novas ferramentas que permitissem a localização de proteínas específicas em bactérias, durante o processo de divisão bacteriana. Para isso, construímos várias ferramentas que permitem a fusão de proteínas de interesse com proteínas fluorescentes em S. pneumoniae, que podem ser usadas noutras bactérias Gram-positivas. Através da manipulação da estrutura e da estabilidade do terminal 5′ da molécula de mRNA, e consequentemente do acesso do ribossoma a esta molécula, foi possível garantir a expressão de proteínas fluorescentes de modo a obter um sinal de fluorescência intenso. Em quase todos os serótipos de pneumococos, a regulação da síntese da cápsula está a cargo das proteínas Wzd e Wze, que co-localizam no septo bacteriano e que garantem a expressão da cápsula nesse local. Neste trabalho, observámos uma interação entre a proteína Wzg, a ligase que está envolvida na ligação da cápsula à parede bacteriana, e a proteína reguladora Wzd. Propusemos que o par Wzd/Wze garante que a bactéria está totalmente envolvida pela cápsula através do recrutamento da proteína Wzg para o septo. Um maior número das enzimas Wzg no septo poderá ajustar o ritmo de ligação da cápsula ao peptidoglicano com o ritmo a que o peptidoglicano é sintetizado. De acordo com este modelo, mutantes em que o gene wzd foi deletado, não apresentam cápsula no septo de divisão, mas mantêm a presença deste polímero na superfície lateral. A ausência de cápsula no septo de divisão parece ser suficiente para tornar as bactérias suscetíveis à lise induzida por hidrolases de peptidoglicano e para diminuir a sua capacidade de causar doença no modelo de infeção de embrião de Danio rerio (peixe-zebra). Estes resultados indicam que ao impedir o completo envolvimento da bactéria pela cápsula, mesmo que de forma transiente ou num local específico, poderemos conseguir facilitar a eliminação de bactérias devido à exposição da parede bacteriana. Uma vez que a presença do par Wzd/Wze é fundamental para que S. pneumoniae consiga causar doença num hospedeiro infetado, decidimos desenvolver um método que permitisse a identificação de compostos capazes de impedir esta interação do par Wzd/Wze no septo de divisão. Para isso, construímos uma estirpe que produz as proteínas Wzd e o Wze ligadas a diferentes proteínas fluorescentes. Assumimos que caso a interação destas proteínas fosse inibida, os sinais de fluorescência associados à proteína Wzd e à proteína Wze, em vez de estarem co-localizados no septo de divisão, estariam espalhados, respetivamente, pela membrana celular e pelo citoplasma. A aplicação deste método foi bem-sucedida dado que a análise de um pequeno número de compostos testados permitiu a identificação de um candidato promissor. Esta tese demonstrou que as bactérias de S. pneumoniae precisam de estar completamente envolvidas por uma cápsula de modo a assegurar a sua sobrevivência na presença de enzimas capazes de degradarem o seu peptidoglicano, ou na presença do sistema imunitário do hospedeiro, e permitiu a identificação de um método para a identificação de compostos que impedem o correto processo de síntese da cápsula.

The ability of Streptococcus pneumoniae to cause disease is dependent on its ability to synthesize a capsular polysaccharide, also known as the capsule. The study of the regulation of the capsule synthesis is crucial for the development of new strategies to fight this human pathogen. To study how capsule synthesis is regulated during the pneumococcal cell cycle, it was necessary to develop improved tools that permit the localization of proteins in dividing pneumococcal bacteria. We have therefore constructed several tools that allow the fusion of proteins of interest with fluorescent proteins in S. pneumoniae and that can be used in other Gram-positive bacteria. By manipulating the structure and stability of the 5′ end of the mRNA molecule, which influences its ability to be recognized by the ribosome, we ensured the expression of the fluorescent protein at levels that result in high fluorescent signals. In most capsular pneumococci, regulation of capsule synthesis requires two proteins, Wzd and Wze, that co-localize at the division septum and guarantee the presence of capsule at this subcellular location. In this work, we detected an interaction between Wzg, the ligase that attaches capsule to the bacterial cell wall, and the regulatory Wzd protein. We propose that the Wzd/Wze pair ensures full encapsulation of bacteria by recruiting higher number of Wzg proteins to the septum, so that the pace of capsule attachment can match the rate of peptidoglycan synthesis. In accordance with this model, pneumococcal wzd null mutants lack capsule at the septum while still having this polysaccharide at their lateral wall. Absence of capsule at the division septum is sufficient to increase encapsulated bacteria susceptibility to lysis induced by PGN hydrolases, as well as to decrease their survival in the zebrafish embryo infection model. These results indicate that impairing the encapsulation process, even if transiently or at localized subcellular sites, facilitates elimination of bacteria by exposing their cell wall. As the presence of a functional Wzd/Wze pair is determinant to pneumococci ability to cause disease in the infected host, we developed a screening method for the identification of compounds that prevent Wzd/Wze interaction or their septal localization. This was achieved through the construction of a mutant pneumococcal strain that encodes Wzd and Wze fused to different fluorescent proteins. We assumed that if Wzd and Wze proteins do not interact, their fluorescent derivatives, which normally are co-localized at the division septum, will spread over the membrane and throughout the cytoplasm, respectively. This screening method was successful, as we identified one promising candidate from a small screen of a few compounds. This thesis shows the importance of full encapsulation of pneumococcal cells for survival in the presence of peptidoglycan hydrolases and for evasion from the host immune system. It has also identified an innovative method to find compounds that interfere with the synthesis of pneumococcal capsule.