Otimização de um protocolo de Real-Time PCR: deteção de DNA de Leptospira spp em amostras biológicas e ambientais

Abstract

A leptospirose é uma doença zoonótica causada por bactérias (espiroquetas) do género Leptospira, que pode infetar os humanos e outros mamíferos. Os roedores são os reservatórios mais comuns das leptospiras. Estas são transmitidas aos humanos pelo contacto direto com a urina, sangue, e outros tecidos infetados dos reservatórios colonizados ou animais infetados, ou indiretamente por água ou solo contaminados com estas bactérias. Assim, a leptospirose tem uma relação direta com condições precárias de saneamento e elevada infestação de roedores. Este estudo teve como objetivo otimizar um protocolo de PCR em tempo real (qPCR), usando primers “LipL32” para deteção de DNA de Leptospira spp em amostras biológicas e ambientais. Para tal, foram selecionados quatro serovares representantes de duas espécies: L. interrogans (serovares Icterohaemorrhagiae e Copenhageni) e L. borgpetersenii (serovares Ballum e Hardjo) para a extração de DNA genómico. Os serovares foram mantidos em meio de cultura seletivo EMJH (Ellinghaussen-McCullough-Johnson-Harris) a 29ºC e sob agitação permanente. As amostras biológicas a estudar foram as seguintes: i) amostras de soro (n=7) e urina (n=5) humanas; ii) sangue (n=3) e baço de roedores (n=3); e iii) amostras ambientais [solos (n=9) e águas (n=17]. Os primers usados tiveram como alvo o gene lipL32, que codifica a lipoproteína da membrana externa com o mesmo nome (LipL32), que é responsável pela patogenicidade destas bactérias. Inicialmente, o DNA genómico foi extraído das culturas puras (serovares) e das amostras biológicas. Foram realizadas diluições sucessivas de base 10 para a determinação do Lower Limit of Detection (LLOD). Este procedimento foi executado em triplicado de forma a aferir-se a reprodutibilidade do método. Foram usadas as culturas puras dos referidos serovares com diluições sucessivas de base 10 e amostras já testadas em estudos anteriores, e cujo resultado havia sido negativo. No teste de especificidade foi incluído um serovar saprófito (Patoc) da espécie L. biflexa e outras espécies de espiroquetas (Borrelia burgdorferi e Treponema pallidum), e um protozoário do género Leishmania. O LLOD de DNA de Leptospira spp dos serovares foi determinado em 100 GE/μl. Este DNA foi misturado com as diferentes amostras para determinar a sensibilidade do teste. No teste de especificidade não foi obtida amplificação de DNA leptospírico. Em relação aos resultados obtidos na nested-PCR e na qPCR com o protocolo “LipL32”, foi observada amplificação de DNA em (10+/44; 22,7%) e (19+/44; 43,2%), respetivamente. Por outro lado, nas amostras (n=34; 77,3%) previamente estudadas pela nested-PCR sem amplificação de DNA de Leptospira spp, quando avaliadas pela qPCR (13+/34; 41,2%) mostraram amplificação de DNA leptospírico. Estes resultados demonstraram que o protocolo de qPCR “LipL32” poderá ser útil na deteção de DNA leptospírico mesmo em baixas concentrações. Assim, a presente abordagem pode melhorar significativamente o diagnóstico laboratorial da leptospirose, principalmente na fase inicial da doença.

Leptospirosis is a zoonotic disease caused by bacteria (spirochetes) of the genus Leptospira, infecting humans and other mammals. Rodents are the most common reservoirs for leptospires. These bacteria are transmitted to humans through direct contact with urine, blood, and other tissues of colonized or infected animals, or indirectly by soils and freshwaters contaminated with these bacteria. Thus, leptospirosis has a direct relationship with precarious sanitation conditions and high rodent infestation. This study aimed to optimize a Real-Time PCR (qPCR) protocol, using "LipL32" primers for DNA detection of pathogenic Leptospira species in biological and environmental samples. For this, we selected four serovars representing two species: L. interrogans (serovars Icterohaemorrhagiae and Copenhageni) and L. borgpetersenii (serovars Ballum and Hardjo) for genomic DNA extraction. The serovars were maintained in selective culture medium EMJH (Ellinghaussen-McCullough-Johnson-Harris) at 29oC and under permanent agitation. The biological samples to study were the following: i) human serum (n=7) and urine (n=5); ii) rodent tissues (n=3) and urine (n=3), and iii) environmental samples [soil (n=9) and freshwater (n=17)]. The primers targeted lipL32 gene, encoding the outer membrane lipoprotein with the same name (LipL32), responsible for Leptospira virulence were used. Firstly, genomic DNA was extracted from pure cultures (serovars) and biological samples. Serial ten-fold dilutions were performed to determine the Lower Limit of Detection (LLOD). This proceeding was executed in triplicate to get the reproducibility of the method. Serovars with serial ten-fold dilutions and samples tested in a previous study, whose result had been negative, were used. The specificity test included a saprophytic serovar (Patoc) of L. biflexa and other spirochetes species (Borrelia burgdorferi and Treponema pallidum) and one protozoan of the genus Leishmania. The LLOD of Leptospira DNA from serovars was determined at 100 GE/μl. DNA was mixed with the different samples to determine the sensitivity of the test. Specificity test showed no leptospiral DNA amplification. Regarding the results of nested PCR and qPCR with the "LipL32" protocol, we observed DNA amplification (10+/44; 22,7%) and (19+/44; 43,2%), respectively. On the other hand, samples (n=34; 77,3%) previously studied by nested PCR without amplifying Leptospira DNA when evaluated by qPCR (13+/34; 41,2%) showed leptospiral amplification DNA. These results showed that the "LipL32" qPCR protocol could be useful to detect leptospiral DNA even at low concentrations. Thus, this approach can significantly improve the laboratory diagnosis of leptospirosis, particularly in the early phase of the disease.