Evolutionary history and phylogeography of the hepatitis C and hepatitis B visuses in Portugal

Abstract

Em 2019, a Organização Mundial de Saúde estimou 354 milhões de pessoas com hepatite B e C crónica a nível mundial. Em Portugal, o mais recente inquérito transversal a nível nacional parece revelar uma diminuição das prevalências de VHB e VHC anteriormente estimadas. A informação sobre a evolução da diversidade viral continua limitada, desconhecendo-se se a epidemiologia molecular das infeções por VHB e VHC tem vindo a ser alterada em Portugal. O objetivo deste estudo foi investigar a história evolutiva de ambos os vírus e a sua filogeografia em Portugal. Os ácidos nucleicos virais foram extraídos do plasma de doentes portugueses com VHB e VHC, os genes pol do VHB e NS5A e NS5B do VHC foram amplificados e sequenciados. A reconstrução de árvores filogenéticas de máxima verossimilhança no software IQtree v1.6.11 foi usada para genotipar as estirpes virais. A história epidémica dos subtipos do VHC em Portugal foi reconstruída através de métodos Bayesianos, conforme implementados no software BEAST v1.10.4, tal como a investigação da origem e das rotas de dispersão de ambos os vírus. As resistências aos antivirais nos dois clades do subtipo 1a do VHC foram analisadas online no Geno2Pheno [HCV] 0.92. Os nossos dados revelaram que o subgenótipo D4 do VHB foi o primeiro a ser introduzido em Portugal cerca de 1857, seguido pelo D3 e A2 algumas décadas mais tarde. Os genótipos E e A1 do VHB foram introduzidos posteriormente, quase em simultâneo. Os nossos resultados revelaram um papel muito importante de Portugal na exportação de D4 e A2 para o Brasil e Cabo Verde, respetivamente, no início do século XX. Em Portugal foram identificados subtipos distintos de VHC que entraram no país ao longo do tempo: subtipo 1b (1930-1960), subtipos 3a (1960s) e 1a (1980s), possivelmente associados a transfusões de sangue contaminado, ao início do uso de drogas intravenosas e ao seu uso generalizado, respetivamente. Os subtipos 4a e 4d, emergiram mais recentemente, possivelmente com o ressurgimento do uso de opiáceos. O subtipo 1a é claramente o mais frequente em Portugal apresentando dois clades diferentes (I e II) a circular na população, que possivelmente possuem vias de transmissão diferentes. Os primeiros países a introduzir os clades I e II em Portugal foram os Estados Unidos da América (1965) e Espanha (1955), respetivamente. Dois subclades, classificados como X e Y, foram identificados entre as estirpes do clade I. As RAS basais no gene NS5A foram encontradas principalmente nas estirpes do clade I/subclade Y, sendo a mutação mais frequente a L31M, que se revelou ausente nas estirpes do clade I/subclade X e do clade II. Este trabalho permitiu conhecer a história epidemiológica do VHB e VHC em Portugal, mostrando que Portugal teve um papel importante na dispersão global do VHB e fornecendo novos conhecimentos sobre a epidemiologia molecular, origem e dinâmica de dispersão do VHC em Portugal. Também indicou algumas estirpes virais de VHC como mais propensas a adquirir RAS e que a resistência aos antivirais deve ser investigada no contexto dos clades/subclades do subtipo 1a.

In 2019, the World Health Organization estimated 354 million people with chronic hepatitis B and C worldwide. In Portugal, the most recent national cross-sectional survey indicates a decrease in previously estimated HBV and HCV prevalence. Information on the evolution of viral diversity remains limited, and it is not known whether the molecular epidemiological profile of HBV and HCV infections has been changing in Portugal. The aim of this study was to investigate the molecular epidemiology and evolutionary history of both viruses and their phylogeography in Portugal. Viral nucleic acids were extracted from the plasma of Portuguese patients infected with HBV and HCV, the pol gene of HBV and NS5A and NS5B genes of HCV were amplified and sequenced. The reconstruction of maximum likelihood phylogenetic trees in the IQtree v1.6.11 software was used for genotyping purposes. The epidemic history of HCV subtypes in Portugal was reconstructed using Bayesian methods, as implemented in the BEAST v1.10.4 software, as in the investigation of the origin and routes of spread of both viruses. Antiviral drug resistance in the two HCV subtype 1a clades were analyzed online in Geno2Pheno [HCV] 0.92. Our data indicated that the D4 subgenotype of HBV was the first to be introduced in Portugal around 1857, followed by D3 and A2 a few decades later. HBV genotypes E and A1 were introduced later, almost simultaneously. Our results revealed a very important role of Portugal in the exportation of D4 and A2 to Brazil and Cape Verde, respectively, in the beginning of the 20th century. Distinct HCV subtypes that entered Portugal over time were identified: subtype 1b (1930- 1960), subtypes 3a (1960s) and 1a (1980s), possibly associated with transfusions of contaminated blood, with the beginning of intravenous drug use and its widespread use, respectively. Subtypes 4a and 4d have emerged more recently, possibly with the resurgence of opiate use. Subtype 1a is clearly the most frequent in Portugal with two different clades (I and II) circulating in the population, which possibly have different transmission routes. The first countries to introduce clades I and II in Portugal were the United States of America Spain (1965) and Spain (1955), respectively. Two subclades, classified as X and Y, were identified among the clade I strains. The basal RAS in the NS5A gene were found mainly in the clade I/subclade Y strains, the most frequent mutation being L31M, which was absent in the strains of clade I/subclade X and clade II. This work allowed us to understand the epidemiological history of HBV and HCV in Portugal, showing that Portugal played an important role in the global spread of HBV and providing new knowledge about the molecular epidemiology, origin and dispersion dynamics of HCV in Portugal. It also highlighted that some viral strains of HCV may be more likely to acquire RAS and that antiviral resistance should be further investigated in the context of subtype 1a clades/subclades.