Vector-pathogen interactomics: connecting the dots

Abstract

As carraças e doenças associadas a carraças têm um impacto negativo considerável na saúde humana e animal. Rhipicephalus bursa é uma carraça multihospedeiro hematófaga e é o principal vetor de Babesia ovis, um hemoparasita altamente patogénico em pequenos ruminantes, que pode levar a uma taxa de mortalidade de 30- 50% em animais suscetíveis e, indiretamente contribuir para um impacto socioeconómico negativo na sociedade humana. O controlo de carraças e doenças associadas depende principalmente do uso de fármacos, que apresentam grandes desvantagens, como a contaminação de alimentos e ambiente e o aumento da resistência, reforçando assim a necessidade de medidas alternativas, como a vacinação. Com base na premissa de que as glândulas salivares da carraça têm um papel crucial no comportamento hematófago e na transmissão de agentes patogénicos, o objetivo principal deste trabalho é aumentar o conhecimento sobre a interação R. bursa-B. ovis neste tecido, de forma a identificar novos candidatos a antigénios protetores para o desenvolvimento de vacinas. Assim sendo, os sialotranscritos e as sialoproteínas de R. bursa foram analisados em diferentes condições, para compreender melhor os processos de alimentação e infeção e contribuir para o desenvolvimento de novas vacinas anti-carraça e doenças associadas. A análise comparativa dos transcriptomas e proteomas revelou que a alimentação por sangue induz a produção de moléculas por parte da carraça, o que se traduziu no aumento da expressão genética e da síntese proteica. Além disso, os dados mostram que a combinação de estímulos (alimentação e infeção) influenciou positivamente a expressão genética, mas negativamente a tradução, podendo sugerir a manipulação de B. ovis no sialoma de R. bursa. Estes resultados aliados a diferentes metodologias como RNA de interferência (in vitro e in vivo) e vacinologia reversa, permitem explorar a maquinaria celular da carraça e identificar vários alvos como potenciais antigénios para vacinas. Os ensaios de silenciamento revelaram o impacto direto de algumas moléculas na sobrevivência da carraça e a sua fixação ao hospedeiro (como a putativa “Vitelogenin-3” e uma proteína do “cement”), enquanto que outros demonstraram um efeito duplo divergente na sobrevivência do vetor e do agente patogénico (como a “lachesin” e a “UB2N”). A análise imunoinformática dos dados anteriores de sequenciação permitiu a identificação de proteínas/peptídeos capazes de induzir, no hospedeiro vertebrado, uma resposta imunológica forte e robusta contra o vetor e o agente patogénico. Nesta análise, uma proteína membranar (proteína contendo domínios “Marvel”) e duas secretórias (uma “Evasin” e uma proteína contendo domínios de “Ricin”) foram selecionadas e promissores "immunological kernels" foram encontrados, contendo características ideais de uma vacina baseada em peptídeos, sem causar alergia e toxicidade. Além disso, a integração de diferentes análises ómicas de diferentes espécies de carraças foi usada como uma estratégia para pesquisar e caracterizar vias biológicas conservadas, a fim de selecionar novos alvos capazes de impactar uma ampla gama de espécies de carraças e bloquear a transmissão de vários agentes patogénicos transmitidos por estas. Deste estudo, destacou-se a via de biossíntese de folato, ao observar que durante a infeção da carraça, quer por bactéria quer por protozoário, a expressão de genes relacionados com esta via era aumentada. No entanto, ensaios de silenciamento numa linha celular de carraça mostraram que, a curto prazo, a redução da expressão de um gene relacionado ao folato (gch-I), não exorta alterações significativas nas células de carraça ou no comportamento do agente patogénico em termos de invasão ou multiplicação. Estudos aplicados e ensaios de vacinação precisam ser conduzidos para validar o potencial desses alvos promissores para o desenvolvimento de abordagens anti-carraça e de bloqueio de transmissão de doenças.

health. Rhipicephalus bursa is a hematophagous multi-host tick and the main vector of Babesia ovis, a highly pathogenic hemoparasite in small ruminants, which leads to a 30-50 % of mortality rate in susceptible animals and, indirectly, to a negative socioeconomic impact in human society. Tick and disease control rely mainly in the use of chemotherapy and acaracides, which has major drawbacks including food and environment contamination and the increase of resistance, reinforcing the need for alternatives measures, such as vaccination. Based on the premise that tick salivary glands have a crucial role on hematophagous behaviour and on pathogen transmission, the main objective of this research was to increase the understanding on the Rhipicephalus bursa- Babesia ovis interaction in this organ, in order to find new protective antigen candidates for vaccine design. Thus, the R. bursa sialotranscripts and sialoproteins were screened under different conditions, to better understand the feeding and infection processes and contribute for the development of new anti-tick and tick-borne diseases. The comparative analyses of the transcriptomes and proteomes revealed that blood feeding induces the production of tick molecules, which was translated by the increased gene expression and protein synthesis. Moreover, the data unveiled that the combination of stimuli (feeding and infection) influenced positively gene expression but negatively translation, suggesting that B. ovis might manipulate R. bursa sialome. These results allied to interference RNA (in vitro and in vivo) and reverse vaccinology, allowed to explore the tick cellular machinery and pinpointed several targets as potential vaccine antigens. The silencing assays revealed the direct impact of some molecules in tick survival and attachment to the host (such as putative Vitellogenin-3 and a Cement protein), while others demonstrated a divergent dual-effect on both vector and parasite survival (such as Lachesin and UB2N). Immunoinformatic analysis of the previous sequencing data allowed the identification of proteins/peptides capable of elicit, in the vertebrate host, a strong and robust immune response against both vector and pathogen. In this experiment, one membrane-related (Marvel-containing protein) and two secreted (a Evasin and a ricin-containing protein) proteins were selected and promising “immunological kernels” were found to have ideal characteristics for an anti-tick peptide-based vaccine, without causing allergy and toxicity. Furthermore, the integration of different omics analyses from different tick species was used as a strategy to search and characterize conserved biological pathways in order to select new targets able to impact a wide range of tick vectors and block the transmission of several transmitted pathogens. From this study the folate biosynthesis pathway stood out by observing that during tick infection, by either bacteria or protozoan, the expression of genes related to this pathway were increased. However, silencing assays in a tick cell line demonstrate that, in a short term, the reduction of expression of a folate-related gene (gch-I), did not lead to significant changes in tick cells or pathogen behaviour of invasion or multiplication. Applied studies and vaccination trials need to be conducted to validate the potencial of these promising targets for the development of anti-tick and transmission blocking approaches.