Exosomes as a potential novel mechanism for HDV transmission independent of HBV infection

Abstract

O Vírus da Hepatite Delta (HDV) é o mais pequeno vírus de RNA conhecido capaz de infetar humanos. A infeção por HDV requer a presença do Vírus da Hepatite B (HBV) para a sua transmissão, sendo a superinfeção por HBV/HDV a forma mais severa de hepatite viral crónica devido à rápida progressão para morte relacionada com doença do fígado. A infeção por hepatite viral aumenta o risco de desenvolver Carcinoma Hepatocelular (HCC) e é o maior fator etiológico na elevada proporção de casos de HCC – estima-se que a coinfecção HBV/HDV é responsável por aproximadamente 20% dos casos de doença hepática e cancro do fígado. A associação entre estes dois vírus explica-se pelo facto de o HDV não codificar proteínas do envelope para o empacotamento e depender das glicoproteínas de superfície do HBV para a montagem do virião e transmissão celular. Contudo, o genoma de RNA do HDV consegue replicar-se eficientemente em diferentes tecidos e espécies, levantando a possibilidade de que o HDV pode ser transmitido independentemente do HBV. Foi recentemente demonstrado que vírus envelopados distintos do HBV podem induzir a propagação do HDV in vivo, sugerindo a existência de vias alternativas para a disseminação do HDV. Neste trabalho, analisamos a existência de exossomas contendo componentes de HDV e que permitiriam ao HDV infetar células hepáticas na ausência do HBV. Exossomas são nanovesículas membranares secretadas por células normais e malignas e são atualmente reconhecidos como estruturas críticas na comunicação intercelular por meio da transferência horizontal de informação através da sua carga, que inclui proteínas seletivas, mRNAs e miRNAs. Curiosamente, exossomas presentes no soro de pacientes cronicamente infetados com HBV contêm ácidos nucleicos e proteínas de HBV, e são capazes de transmitir o vírus a hepatócitos saudáveis. Para a purificação de exossomas foram usadas duas linhas celulares humanas, Huh7-D12 e a sua linha celular parental, Huh7. Huh7-D12 replica o genoma do HDV e expressa constitutivamente todos os seus componentes. Sobrenadantes de células que expressam o HDV foram transferidos para células humanas que não expressam HDV e a expressão do vírus foi analisada por PCR. A análise do RNA e da composição proteica desses exossomas foi também realizada. Sobrenadantes de células Huh7-D12 e Huh7 crescidas exponencialmente foram usados para isolar e purificar exossomas usando kits e protocolos comerciais padrão. Mostramos que o RNA genómico de HDV está presente em exossomas de Huh7-D12, assim como importantes RNAs humanos (GAPDH e snRNPs). Os sobrenadantes de Huh7-D12 contendo HDV foram transferidos para células que não expressam HDV, as quais foram posteriormente observadas a expressar componentes de HDV. Os exossomas participam na comunicação célula a célula transportando moléculas para células recetoras. Além de estarem envolvidos em processos fisiológicos normais, também estão associados ao desenvolvimento e progressão de muitas doenças, incluindo cancro. Os vírus de hepatite usam exossomas para transferir material genético viral, proteínas sinalizadoras e RNAs funcionais para células não infetadas, facilitando a propagação viral. Concluímos que células Huh7-D12 secretam exossomas que contêm o RNA genómico de HDV e que exossomas contendo HDV podem constituir um mecanismo alternativo de disseminação do HDV independente do HBV.

Hepatitis delta virus (HDV) is the smallest known human-infecting RNA virus, first described in the late 1970s. HDV infection requires the Hepatitis B virus (HBV) for its replication, with the HBV/HDV superinfection being the most severe form of chronic viral hepatitis due to more rapid progression towards liver-related death. Hepatitis viral infection increases the risk of developing Hepatocellular Carcinoma (HCC) and is a major etiological factor in a large proportion of HCC cases – it was estimated that HBV/HDV co-infection is responsible for nearly 20% of liver disease and liver cancer cases. The association between these two viruses is explained by the fact that HDV does not encode envelope proteins for packaging and relies on the HBV surface glycoproteins for virion assembly and cellular transmission. However, HDV RNA genome can efficiently replicate in different tissues and species, raising the possibility that HDV can be transmitted independently of HBV. It was recently demonstrated that enveloped viruses distinct from HBV can induce HDV spread in vivo, suggesting the existence of alternative pathways for HDV to disseminate. In this work, we analysed the existence of exosomes containing HDV components that would allow HDV to infect liver cells in the absence of HBV. Exosomes are membrane-derived nanovesicles secreted by both normal and malignant cells that are currently recognized as critical structures in intercellular communication through horizontal transfer of information via their cargo, which includes selective proteins, mRNAs and miRNAs. Interestingly, exosomes present in the sera of chronic HBV patients contain HBV nucleic acids and proteins and are able to deliver HBV to healthy hepatocytes in an active manner. Two human cell lines, Huh7-D12 and its parental cell line, the human hepatocarcinoma Huh7 were used to purify exosomes. Huh7-D12 replicates the HDV genome and constitutively expresses all HDV components. Supernatants of HDV-expressing cells were transferred to human cells that do not express HDV and HDV expression was analysed by PCR. Analysis of the RNA and protein composition of these exosomes was also performed, including a proteomic analysis of Huh7-D12-derived HDV-containing exosomes. Supernatants from exponentially grown Huh7-D12 and Huh7 cells were used to isolate and purify exosomes using standard commercial kits and protocols. We show that HDV genomic RNA is present in exosomes from Huh7-D12 cells, along with important human RNAs (GAPDH and snRNPs). Exosome-containing Huh7-D12 supernatants were transferred to non-expressing HDV cells, which were subsequently observed to express HDV components. Exosomes participate in cell-to-cell communication by transporting molecules to recipient cells near or distant from the original cells. Besides being involved in normal physiological processes, they are also associated with the development and progression of many diseases including cancer. Hepatitis viruses use exosomes to transfer viral genetic material, signaling-competent proteins and functional RNAs to uninfected cells to facilitate viral spread. We conclude that Huh7-D12 cells secrete exosomes that contain the HDV genomic RNA and that HDV-containing exosomes may constitutive an alternative mechanism of HDV dissemination independent of HBV.