Genetic characterization of rotavirus strains in Mozambique, 2012-2018: identification of rotavirus genotypes and full genome sequencing by next generation sequencing

Abstract

Os rotavirus do grupo A são uma das principais causas de diarreia aguda grave em crianças menores de 5 anos de idade em todo o mundo. Os vírus também causam infecção em animais jovens de variadas espécies de mamíferos e aves. Existem vários genótipos de rotavirus que causam infecção em crianças, por isso, as pesquisas sobre a circulação e prevalência de estirpes de genótipos de rotavirus circulantes e o sequenciamento do genoma completo são importantes para caracterizacção genética do vírus no país, auxiliando assim na avaliação do impacto da vacina contra rotavirus introduzida no programa alargado de vacinação em Setembro de 2015. Neste contexto, o principal objetivo deste projeto foi caracterizar geneticamente as estirpes de rotavirus circulantes entre 2012 e 2018 em Moçambique, incluindo uma comparação antes e após a introdução da vacina contra rotavirus no país. As estirpes de rotavirus foram detectadas em crianças menores de cinco anos de idade que apresentaram diarreia aguda grave. A caracterização genética de rotavirus foi realizada utilizando RT-PCR, sequenciação de moléculas de DNA pelo método de paragem da polimerização por incorporação de didesoxirribonucleótidos (método de Sanger) e sequenciação do genoma completo da segunda geração (Next Generation Sequencing). Os resultados de RT-PCR mostraram a alta diversidade de genótipos circulantes com variações anuais no período pré e após a introdução da vacina, conforme reportado anteriormente por vários estudos a nível mundial. Antes da introdução da vacina (2012-2013), os genótipos de rotavirus mais frequentes foram G2P[4] e G12P[6] e durante 2014-2015 foram G1P[8] e G9P[8]. Após a introdução da vacina (2016-2018), observou-se o surgimento dos genótipos emergentes como G9P[4], G3P[4] e G3P[8] que não tinham sido detectados antes. O surgimento de novos genótipos de rotavirus no período pós-vacinal reforça a necessidade de uma vigilância contínua em todo o país para monitorizar se o aparecimento de outros genótipos foi devido a vacina. A análise do genoma completo das estirpes dos genótipos G1P[8] e G9P[8] de 2014 e 2016 revelou a circulação de estirpes com um backbone Wa-like típico. Com as análises do genoma completo, foi possível fornecer evidências da diversidade genética do genótipo P[8] em Moçambique ao longo dos anos e foram observadas várias substituições nas regiões antigénicas de rotavirus, sendo importante continuar a vigilância das genótipos para monitorizar o efeito dessas mutações. A análise do genoma completo das estirpes dos genótipos G2P[6] circulantes em 2015 e 2016 revelou um backbone DS1-like típico com alta identidade com estirpes moçambicanas que circularam em 2012 e 2013, entretanto, foram detectados possíveis eventos de reassortments. No presente estudo, apesar da análise do genoma completo de rotavirus ter sido efectuada em estirpes provenientes de diferentes locais de Moçambique, os resultados ilustraram que no país estão em circulação estirpes com o mesmo genetic makeup. Esta tese caracterizou estirpes de rotavirus do grupo A em crianças menores de 5 anos de idade e mostrou a existência de alta diversidade de estirpes circulantes no país. A análise do genoma completo evidenciou que estirpes G1P[8] e G9P[8] têm um backone Wa-like típico e estirpes G2P[6] têm um backbone DS1-like típico. No entanto, é importante a vigilância contínua, como forma de monitorizar os possíveis eventos de reassortment que derivam da pressão da vacina.

Rotavirus group A were confirmed as a major cause of life-threatening diarrhoea in infants and children <5 years of age worldwide and in the young of many mammalian and avian species. The virus is known to have several rotavirus strains causing infection in children, due to that, the assessment of information on the prevalence of circulating rotavirus strains as well the complete genetic makeup is important in the assessment of the likely impact of vaccine. In this context the main aim of this project was to genetically characterize the rotavirus strains circulating between 2012-2018 in Mozambique, including a comparison before and after rotavirus vaccine implementation in the country. The strains were from children under five years of age and suffering from moderate-to-severe acute diarrhoea. The genetic characterization was done using RT-PCR, dideoxynucleotide chain termination sequencing (Sanger method) and next generation sequencing of rotavirus genome. The results by RT-PCR showed diversity of genotypes with yearly fluctuations of strains, prior and post vaccine introduction. Prior to vaccine introduction, during 2012-2013, the most frequent rotavirus genotypes were G2P[4] and G12P[6] and during 2014-2015 were G1P[8] and G9P[8]. Post vaccine-introduction (2016-2018) was observed emergence of genotypes G9P[4], G3P[4] and G3P[8]. The emergence of other rotavirus strains in the post-vaccination period supports the need for continuous surveillance across the country to understand if the emergence of the strains is vaccine derived and their impact in human health. The full genome analysis of G1P[8] and G9P[8] strains from 2014 and 2016 revealed circulation of strains with typical Wa-like genome backbone. With full genome analyses, it was possible to provide evidence of genetic diversity within genotype P[8] in Mozambique throughout the years and several substitutions in rotavirus antigenic regions were observed. It is, thus, important to continue surveillance of rotavirus strains to monitor the implication of these mutations. The full genome analysis of G2P[6] strains from 2015 and 2016 revealed a DS1-like typical genome backbone with high identity with Mozambican strains from 2012-2013, however, with possible occurrence of reassortment events.The rotavirus genome of strains from different sites from Mozambique analysed in the present study showed, in general, the same genetic makeup of rotavirus strains in the country. This thesis characterized the RVA strains from children less than five years of age and showed high diversity of strains in Mozambique. The full genome analyses showed Wa-like with typical genome backbone in strains G1P[8] and G9P[8], and DS1-like with typical genome backbone in G2P[6] strains. There is a need to continue the surveillance in order to monitor possible reassortment events derived from vaccine pressure.