Imunonanodiagnóstico da pneumonia por Pneumocystis (PPc) uma abordagem inovadora baseada na associação de biossensores antigénicos e nanopartículas de ouro

Abstract

Pneumocystis jirovecii é um fungo oportunista, de distribuição mundial, capaz de provocar pneumonia fatal em imunocomprometidos. Atualmente, o diagnóstico da pneumonia por Pneumocystis (PPc) baseia-se na visualização microscópica de P. jirovecii e/ou na deteção do seu ADN em amostras respiratórias obtidas por métodos dispendiosos e invasivos. Assim, o desenvolvimento de um método de diagnóstico simples, rápido, económico e menos invasivo, é uma necessidade premente. Neste contexto, este trabalho teve como objetivo desenvolver abordagens alternativas de serodiagnóstico da PPc, aplicando antigénios recombinantes sintéticos (ARS) multi-epítopo específicos de P. jirovecii na deteção de anticorpos séricos anti-P. jirovecii em doentes com e sem infeção por este microrganismo. Dois ARS foram desenhados com base no estudo in silico da imunogenicidade da glicoproteína major de superfície (Msg, major surface glycoprotein) e da serina protease Kex1 de P. jirovecii, duas proteínas com propriedade antigénicas descritas. Após síntese e purificação, esses ARS foram aplicados como ferramentas antigénicas no desenvolvimento e otimização de ELISA (enzyme-linked immunosorbent assays) indiretos para deteção de anticorpos IgG e IgM anti-P. jirovecii em amostras de soro de doentes previamente classificados em grupos clínicos distintos. Seguidamente, realizou-se uma avaliação do desempenho diagnóstico dos ELISA desenvolvidos. Esses ARS foram também conjugados com AuNP previamente funcionalizadas e a interação desses bioconjugados com anticorpos séricos anti-P. jirovecii foi caracterizada por ensaios de eletroforese em gel de agarose (EGA), na presença e ausência de agentes de bloqueamento. Por fim, os bioconjugados foram aplicados na otimização de testes de tiras projetados para detetar anticorpos séricos da classe IgM reativos contra cada um dos ARS produzidos, tendo sido criada uma zona teste com anticorpos anti-IgM humana e uma zona controlo com anticorpos anti-ARS. ELISA desenvolvidos com ambos os ARS mostraram que somente os níveis serológicos de anticorpos da classe IgM estavam significativamente aumentados em doentes com PPc em comparação com doentes sem infeção por este microrganismo. Adicionalmente, o desempenho dos testes ELISA baseados na deteção do nível desses anticorpos no diagnóstico da PPc apresentou sensibilidades de 68.0% e 70.8% e especificidades de 61.8% e 75.0% com o ARS da Msg e o ARS da Kex1, respetivamente. Os ensaios de EGA mostraram que os bioconjugados, após bloqueamento apropriado com caseína, eram capazes de interagir especificamente com anticorpos anti-P. jirovecii presentes no soro de doentes. Os testes de tira desenvolvidos, testados com soros de doentes com e sem infeção por P. jirovecii, apresentaram resultados concordantes com o desempenho esperado, nomeadamente linhas vermelhas na zona teste e controlo com amostras de doentes e apenas uma linha vermelha na zona controlo com amostras de indivíduos sem a doença. Estes resultados suportam a possibilidade de se diagnosticar PPc utilizando os ARS produzidos como ferramentas para deteção serológica de anticorpos IgM anti-P. jirovecii. As alternativas de diagnóstico aqui apresentadas devem ser otimizadas e validadas para sua posterior implementação na prática clínica, esperando-se um impacto positivo não apenas nas regiões economicamente desenvolvidas, mas também nas comunidades de baixa renda e com acesso escasso às tecnologias existentes para o diagnóstico desta doença oportunista potencialmente fatal.

Pneumocystis jirovecii is a ubiquitous opportunistic fungus able to cause fatal pneumonia in immunocompromised patients. Currently, Pneumocystis pneumonia (PcP) diagnosis relies on microscopic visualization of P. jirovecii organisms or its DNA detection in respiratory specimens obtained by invasive and costly techniques. Thus, the development of a simpler, faster, cost-effective and less-invasive diagnostic approach is mandatory. In this context, this work aimed to develop alternative serodiagnostic approaches for PcP, applying innovative P. jirovecii recombinant synthetic (multi-epitope) antigens (RSA) in the detection of specific anti-P. jirovecii antibodies in human serum specimens. Two RSA were designed based on the immunogenicity of P. jirovecii major surface glycoprotein (Msg) and kexin-like serine protease (Kex1), two highly antigenic proteins of this pathogen. After synthesis and purification, these RSA were applied as antigenic tools in indirect enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) for detection of serum anti-P. jirovecii antibodies in patients previously classified in distinct clinical groups. A diagnostic performance assessment of each RSA-based ELISA was performed. The RSA were also conjugated with previously functionalized AuNP and the interaction of these bioconjugates with specific anti-P. jirovecii antibodies was characterized by agarose gel electrophoresis (AGE), in the presence and absence of blocking agents. Then, the bioconjugates were used in the development of two strip-based lateral flow immunoassays, comprising a test zone with anti-human IgM antibodies and a control zone with anti-RSA antibodies, projected to detect the presence of human IgM antibodies reactive to each P. jirovecii RSA produced. ELISA results with both RSA showed that only IgM anti-P. jirovecii levels were significantly increased in patients with PcP compared with patients without P. jirovecii infection. In addition, these IgM RSA-based ELISA allowed a diagnostic performance of PcP with sensitivities of 68.0% and 70.8% and specificities of 61.8% and 75.0% with Msg RSA and Kex1 RSA, respectively. AGE assays showed that after proper blocking with casein, the bioconjugates were able to react specifically with anti-P. jirovecii antibodies present in patients sera. The strip-based tests developed were tested with pools of sera from patients with PcP (positive sample) and from patients without P. jirovecii infection (negative sample). Both samples showed the expected performance namely test and control red-colored lines with the positive sample and only a control red-colored line with the negative sample. These results support the possibility to diagnose PcP using the designed RSA as recognition tools and IgM anti-P. jirovecii antibodies as targets for immunodiagnosis. Optimization and validation of the alternative diagnostic approaches presented in this study are necessary in order to enable their implementation in clinical practice. A positive impact is expected not only on economically advanced regions, but also on low-income communities with scarce access to the technologies currently available to diagnose this life-threatening opportunistic disease.