Disease correction and generation of isogenic induced pluripotent stem cell lines for diasease modelling in patients with DAND5 mutations

Abstract

As doenças cardiovasculares são a principal causa de morbidade e mortalidade, principalmente nos países desenvolvidos. Para melhorar as terapias já existentes para o miocárdio é necessário, em primeiro lugar, compreender claramente os mecanismos moleculares e as vias de sinalização envolvidas por trás da cardiomiogénese. Utilizando um modelo de ratinho, foi possível observar o papel do DAND5 em dois processos embrionários distintos, um relacionado com o estabelecimento de LR e outro relacionado com a proliferação de cardiomiócitos. Além disso, em um projeto de sequenciamento do exoma, desenhado para identificar mutações associadas à assimetria esquerda-direita (LR) em humanos identificou-se uma mutação missense (c.455G>A) no exão 2 do gene DAND5 de dois doentes vivos independentes, apresentando características de assimetria LR e defeitos cardíacos associados. De acordo com a análise funcional in vitro, essa mutação leva a uma diminuição na função inibitória da proteína DAND5. No entanto, ainda há muito a aprender sobre a função de DAND5 durante a diferenciação em relação aos cardiomiócitos em humanos. Com isso em mente, iPSCs humanas (hiPSCs) derivadas de diferentes pacientes com mutação em DAND5 foram estabelecidas. Mas, para estabelecer modelos para estudar a função deste gene e, em particular, a alteração c.455G> A, linhas isogénicas de células estaminais pluripotentes induzidas (iPSC) corrigidas em DAND5 devem ser geradas. Este é um controlo importante para superar o ruído fenotípico causado por fundos genéticos variáveis de linhas PSC não relacionadas. Assim como, a geração de linhagens isogénicas de iPSC DAND5 mutantes para esclarecer o efeito da completa perda de função de DAND5 durante a diferenciação em cardiomiócitos Aqui, usando a edição de genoma mediada por CRISPR, fomos capazes de corrigir a mutação em DAND5 e gerar uma linha isogénica de hiPSC corrigida em DAND5, ou seja, é homozigótica para a base c.455G, confirmada por sequenciamento. Assim como de gerar uma isogénica hiPSC com o knockout de DAND5, após a utilização da edição do genoma mediada por CRISPR para inserir codões stop prematuros, confirmados por sequenciamento, tornando-se o gene DAND5 inoperante. A sua análise mostra então que esta linha celular mantém as propriedades hiPSC: morfologia tipo célula estaminal embrionária (ESC); análise de imunofluorescência (IF) confirmou a expressão do fator de transcrição e autorrenovação OCT4 e do marcador de superfície SSEA4, marcadores característicos de células estaminais pluripotentes; diferenciação in vitro baseada no corpo embrionário (EB) seguida de análise IF do marcador endodérmico alfafetoproteína (AFP), do marcador mesodérmico actina alfa do músculo liso (SMA) e o marcador ectodérmico tubulina βIII (TUBB3) confirmaram a pluripotencia das hiPSC e a sua capacidade de se diferenciar em todas as três camadas germinativas. Essas linhas de hiPSC são agora ferramentas úteis para a modelação de doenças e para entender o papel desse gene em pacientes com mutações em DAND5, rastreio de drogas e medicina regenerativa. Especialmente para o estudo dos mecanismos moleculares relacionados com a proliferação de cardiomiócitos.

Cardiovascular diseases are the leading cause of morbidity and mortality, mainly in developed countries. To improve already existing therapies for myocardium is firstly necessary to clearly understand the molecular mechanisms and signalling pathways involved behind cardiomyogenesis. Using a mouse model, it was possible to observe the role of DAND5 in two distinct embryonic processes, one related with the LR establishment and the other is related with the cardiomyocyte proliferation. Besides, on an exome sequencing project designed to identify mutations associated to left-right (LR) asymmetry in humans, it was identified a missense mutation (c.455G>A) in exon 2 of the DAND5 gene from two independent living patients presenting characteristic LR asymmetry-associated heart defects. According to functional analysis in vitro, this mutation leads to a decrease in the inhibitory function of the DAND5 protein. However, a lot remains to be learned about the function of DAND5 during differentiation towards cardiomyocytes in humans. With this in mind, human iPSCs (hiPSCs) derived from different patients with DAND5 mutation have been established. But, to establish models to study the function of this gene and, in particular, the c.455G>A alteration, isogenic DAND5-corrected induced pluripotent stem cell (iPSC) lines must be generated. This is an important control to overcome the phenotypic noise caused by variable genetic backgrounds of unrelated PSC lines. Even as, the generation of isogenic full-mutant DAND5 iPSC lines in order to clarify the effect of the complete DAND5 loss-of-function during differentiation towards cardiomyocytes Here, using CRISPR-mediated genome editing, we were capable to correct the defective DAND5 mutation and generate an isogenic DAND5-corrected hiPSC line, that means, is homozygous for the c.455G base, confirmed by sequencing. As well as generate an isogenic DAND5 knockout hiPSC, after using CRISPR-mediated genome editing to insert premature stop codons, confirmed by sequencing, made the DAND5 gene inoperative. Their analysis show then this cell line maintains the hiPSC properties: embryonic stem cell (ESC)-like morphology; immunofluorescence (IF) analysis confirmed the expression of self-renewal transcription factor OCT4 and the surface marker SSEA4, characteristic markers of pluripotent ESCs; in vitro embryoid body (EB)-based differentiation followed by IF analysis of the endodermal marker α-feto protein (AFP), the mesodermal marker smooth muscle actin (SMA) and the ectodermal marker βIII-tubulin (TUBB3) confirmed the pluripotency of hiPSCs and their ability to differentiate into all three germ layers. These hiPSC lines are now useful tools for disease modelling to understand the role of this gene in patients with DAND5 mutations, drug screening and regenerative medicine. Specially to study the molecular mechanisms related to the cardiomyocyte proliferation.