Novas abordagens de diagnóstico da pneumonia por Pneumocystis jirovecii (PPc): potencial diagnóstico dos anticorpos IgA específicos na saliva

Abstract

Pneumocystis jirovecii é um fungo com alta variabilidade genética, com tropismo e especificidade para o pulmão humano e capaz de provocar pneumonia intersticial severa em indivíduos imunocomprometidos. Tendo em conta que o diagnóstico laboratorial da pneumonia por Pneumocystis (PPc) depende da obtenção de espécimes respiratórios maioritariamente obtidos de forma invasiva e da visualização do microrganismo mediante técnicas morosas e onerosas, torna-se necessário explorar novas abordagens. Assim, é premente a obtenção de uma técnica de diagnóstico mais rápida e menos dispendiosa do que as existentes e que utilize amostras biológicas de obtenção pouco ou não invasiva. A IgA secretória é uma imunoglobulina que existe nas secreções nomeadamente na saliva, lágrimas e mucosas. Assim, a pesquisa de IgA anti-P. jirovecii em saliva, parece ser uma abordagem promissora no desenvolvimento de métodos de diagnóstico não invasivos da PPc. O presente trabalho teve como objetivo principal avaliar os níveis de IgA anti-P. jirovecii presentes na saliva de doentes com PPc e em doentes com outras patologias pulmonares, recorrendo a um antigénio recombinante sintético (ARS) de P. jirovecii previamente desenhado como ferramenta antigénica pelo grupo de investigação em Protozoários Oportunistas/VIH e Outros Protozoários do Instituto de Higiene e Medicina Tropical, e aplicá-lo no desenvolvimento de uma plataforma imunoenzimática de diagnóstico da PPc. Para tal, no presente estudo foram colhidas secreções brônquicas e saliva de 85 doentes adultos com patologia pulmonar, que recorreram aos serviços do Hospital Egas Moniz para execução de broncofibroscopia, entre os meses de fevereiro e julho de 2018. Todos os doentes participantes assinaram um consentimento informado. As secreções brônquicas foram utilizadas para efetuar o diagnóstico laboratorial padrão da PPc, por imunofluorescência com anticorpos monoclonais e nested-PCR, e para categorizar os doentes em três categorias distintas: doentes com PPc, doentes com infeção assintomática por P. jirovecii (colonizados) e doentes sem infeção por P. jirovecii. Verificou-se que somente 4,8% da população analisada correspondia a doentes com PPc (infeção sintomática) e que não existia uma diferença estatisticamente significativa entre os níveis de IgA anti-P. jirovecii detetados nos doentes com PPc comparativamente a doentes colonizados (assintomáticos) por P. jirovecii (p=0.593) ou doentes sem infeção por P. jirovecii (p=0,494), com a técnica ELISA (do inglês, Enzyme-linked immunosorbent assay) desenvolvida. Contudo, os títulos médios de anticorpos IgA anti-P. jirovecii detetados na saliva de doentes com infeção por P. jirovecii foi superior ao detetado nos doentes sem infeção por P. jirovecii. Assim, considerando o benefício que trará para o doente e para o controlo clínico desta doença a possibilidade de utilização deste tipo de amostras para diagnóstico da PPc, um novo estudo com uma amostragem mais equilibrada entre as categorias de doentes deve ser feito, por forma a se reavaliar a aplicabilidade das IgA secretórias no diagnóstico desta patologia.

Pneumocystis jirovecii is a fungus with high-genetic variability, tropism and specificity for the human lungs, able to cause interstitial pneumonia (PcP) in immunocompromised patients. Actually, the diagnose of PcP requires the collection of invasive biological specimens and the visualization of the microorganism through time-consuming and costly techniques. Therefore, new approaches for PPc diagnosis should be developed to reduce the overall cost and time, and to use non-invasive biological specimens. IHTM’s investigation group on Opportunistic Protozoa/HIV and Other Protozoa has developed a synthetic recombinant antigen (SRA) specific for P. jirovecii, able to detect, with good specificity and sensitivity, IgM and IgG anti-P jirovecii antibodies in serum specimens. Based in these preliminary results, the group decided to assess the use of this SRA as antigenic tool to detect IgA anti-P. jirovecii in saliva specimens. The IgA it’s an immunoglobulin that exists in bodily secretions such as saliva, tears, and mucus, making this specimen very attractive for non-invasive diagnosis of PcP. The aims of this thesis consisted on the evaluation of the IgA anti-P. jirovecii levels in saliva from patients with PcP and patients with other pulmonary disorders, using the SRA produced previously as an antigenic tool, and the development of an immunoenzymatic platform for the diagnosis of PPc. In this study, bronchial secretions and saliva specimens were collected from 85 adult patients with pulmonary disorders, who performed bronchofibroscopy at Egas Moniz Hospital between February and July 2018. All participants signed an informed consent. All bronchial secretions were used to perform the standard laboratory diagnosis of PcP, by immunofluorescence with monoclonal antibodies (IFI) and nested-PCR, and to categorize patients into three distinct categories: patients with PPc, patients with asymptomatic infection by P. jirovecii (carriers) and patients without P. jirovecii infection. Only 4.8% of the analysed population had PcP (symptomatic) and no significant difference was observed between the levels of IgA anti-P jirovecii across patients in each of the three groups (p=0.593 for comparison between patients with PcP and carriers; p=0,494 for comparison between patients with PcP and patients without P. jirovecii infection) with the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) developed. However, the average levels of IgA anti-P. jirovecii detected on patients with P. jirovecii infection were higher than those detected in patients not infected by P. jirovecii. Therefore, it is suggested that a new study should be carried out, using more balanced sampling methods across the different categories of patients, in order to reassess the applicability of secretory IgA in the diagnosis of PcP.