Infeção por Treponema pallidum subespécie pallidum numa população de homens que têm sexo com homens (HSH): avaliação de técnica de PCR em tempo real

Abstract

A sífilis é uma doença sexualmente transmissível, de distribuição mundial, que emergiu na Europa há mais de 500 anos. O seu agente etiológico é Treponema pallidum subespécie pallidum, que tem o ser humano como o seu hospedeiro natural. Treponema pallidum subespécie pallidum pertence ao filo das Spirochaetes, à ordem Spirochaetales, família Spirochaetaceae e ao género Treponema. Estes são microrganismos procariotas espiralados, flexíveis, filamentosos de extremidades afiladas, bacilos finos e helicoidais que apresentam uma mobilidade em “saca-rolhas” consequência da sua forma espiralada. A infeção por Treponema pallidum evolui em quatro estádios (sífilis primária, secundária, latente e terciária) com períodos sintomáticos e assintomáticos. O diagnóstico da sífilis é difícil, principalmente durante os períodos de latência é dependente de dados clínicos e laboratoriais, uma vez que não existe nenhum teste que possibilite um diagnóstico definitivo em todos os estádios da doença. Os objetivos deste estudo compreendem a análise do valor diagnóstico dos testes serológicos TPHA, Determine e RPR, assim como de uma técnica de PCR em Tempo Real (PCR-TR), comparando-a também com a técnica de PCR-Multiplex (PCR-M). De entre os testes serológicos, o Determine apresentou uma maior reatividade quando comparado com o TPHA e o RPR, apesar da discrepância observada entre os dois testes treponémicos ser mínima (2,7%). Como esperado, observou-se uma diferença significativa entre o RPR e os testes treponémicos (30,2%), que em grande parte poderá ser devido a casos de sífilis curada. Em relação à pesquisa de DNA de T. pallidum observou-se uma taxa de concordância entre as duas técnicas de PCR (Multiplex e Tempo Real) de 92,6%. A técnica de PCR-M foi capaz de identificar DNA num maior número de amostras de sangue (8,3%) do que a técnica de PCR-TR (2,8%), mas esta última identificou-o num maior número de amostras de lesões (26%) versus PCR-M (12%). A pesquisa de DNA de T. pallidum pela técnica de PCR-M foi efetuada utilizando dois genes (Lp 47kDa e PolA): o fragmento do gene Lp 47kDa foi identificado num número superior de amostras de lesões e de sangue do que o fragmento PolA. A técnica de PCR- -TR apenas efetuou a pesquisa do fragmento do gene PolA. Deste estudo foi possível inferir que: a) o teste Determine demonstrou ser comparável aos testes RPR e TPHA, b) o gene Lp 47kDa pareceu ser mais fácil de identificar nas amostras estudadas, c) a identificação dos dois permite detetar DNA de T. pallidum num maior número de amostras, d) em relação à comparação das duas técnicas de PCR verificou-se que o tipo de amostra analisada tem um impacto nos resultados obtidos por esta metodologia e parece que com a técnica de PCR-TR se obtém melhores resultados em amostras de lesões do que de sangue.

Syphilis is a sexually transmitted disease with worldwide distribution that emerged in Europe over 500 years ago. Treponema pallidum subspecies pallidum is the etiological agent of syphilis and its natural host is the human body. This bacterium belongs to the phylum Spirochaetales, the family Spirochaetaceae and the genus Treponema. Theses prokaryote microorganisms are motile spiral-shaped, moving with a corkscrew motion, bending and flexing, characteristic of its spiral form. Infection by Treponema pallidum occurs in four different stages (primary, secondary, latent and tertiary), evolving from one phase to the next, with symptomatic and asymptomatic periods. The diagnosis of this disease is both complex and difficult, especially during the latent phase and relies heavily on clinical and laboratory data, due to the lack of a gold standard test, able to identify the disease in all stages. The aim of this thesis was to analyse the diagnostic value of the TPHA, Determine and RPR tests, as well as the value of our Real Time Polymerase Chain Reaction (PCR- -RT), also by comparison with a PCR-Multiplex technique. Our results showed that among the serological tests, Determine had the highest reactivity when compared to both TPHA and RPR, although a slight discrepancy was observed (2,7%) between the two treponemic tests. As expected, a significant discrepancy was detected between the RPR and treponemic tests (30,2%), which was mainly attributed to treated syphilis cases. In regard, to the identification of T. pallidum DNA, an agreement of 92,6% was found between both PCR techniques (PCR-RT & PCR-M). The PCR-M technique was able to identify DNA in a larger number (8,3%) of blood samples than the PCR-RT, however this technique identified DNA in a higher number (26%) of lesion samples versus the PCR-M (12%). The PCR-M technique was used to identify the fragments of two genes (Lp 47kDa & PolA), while the PCR-RT only used the PolA gene fragment. The PolA gene fragment was identified in a lesser number of blood and lesion samples than the Lp 47kDa. In regard to this thesis results, the following conclusions were deduced: a) the Determine test proved to be comparable to the RPR and TPHA tests, b) the simultaneous identification by two genes allowed for the detection of T. pallidum DNA in a greater number of samples, c) the gene Lp 47kDa was identified more often in the samples analysed, d) when the PCR techniques were compared the type of sample analysed had a direct impact on the technique’s performance. Furthermore, it seems that with the PCR- -RT technique better results were achieved, when applied to lesion samples than blood.