Diversidade genética e estrutura populacional do nemátode parasita Dirofilaria immitis em Portugal através do estudo de microssatélites

Abstract

A dirofilariose é uma doença causada pelo nemátode parasita Dirofilaria immitis, transmitido por mosquitos culicídeos (Aedes, Anopheles e Culex). O hospedeiro definitivo são canídeos e felídeos, e o ser humano é afetado acidentalmente. Este estudo teve como objetivos: Montar, no laboratório, um painel de 11 microssatélites A2, A5, B5, H5, H4, E4, D2, A4, C2, H5, G9 e A05 descritos para D. immitis, avaliar a aplicação em parasitas adultos e microfilárias no sangue, determinar a sua diversidade por regiões em Portugal, comparar com outros marcadores previamente usados (espaçador interno transcrito 2 ribossomal - ITS2). Foram estudados um total de 23 amostras, 11 amostras de vermes adultos, machos e fêmeas provenientes de um cão, e 12 amostras de sangue de cão confirmadas com microfilárias de D. immitis. A região do ITS2 de vermes adultos foi amplificada por PCR, sequenciada e comparada com sequências obtidas de amostras de sangue e de vetor de Portugal e outras regiões. Amplificou-se por PCR onze marcadores de microssatélites. Os produtos de PCR de microssatélites foram detetados em gel de agarose e separados para genotipagem em eletroforese em gel de poliacrilamida. Detetaram-se polimorfismo em oito dos nove microssatélites estudados. Foram encontrados nove perfis alélicos para nove loci e doze perfis alélicos parciais (seis loci) para todas as amostras. Cada região geográfica (Distritos de Santarém e Coimbra) apresentou diversidade alélica. Em conclusão, os marcadores de microssatélites utilizados e analisados em gel de poliacrilamida, podem ser considerados mais informativos para estudos de diversidade populacional em D. immitis em Portugal do que a sequência da região ITS2.

Dirofilariasis is a disease caused by the parasitic nematode Dirofilaria immitis, which is transmitted by culicidae mosquitoes (Aedes, Anopheles e Culex). Canids and felids are definitive hosts, accidentally infecting humans. The objectives of this study were to mount in laboratory, one panel of 11 microsatellites A2, A5, B5, H5, H4, E4, D2, A4, C2, H5, G9 e A05 described for D. immitis, evaluate their application in adult parasite and blood microfilariae, determine their diversity in different Portuguese regions, and compare with previously used genetic markers (ribosomal internal transcribed spacer 2 - ITS2). A total of 23 samples were studied, including 11 adult worms, male and female, isolated from one dog, and 12 canine blood samples confirmed to D. immitis microfilariae. The ITS2 region from adult worms was amplified by PCR, sequenced and compared to previously obtained sequences from blood and vector samples from Portugal and other countries. Eleven microsatellite markers were amplified by PCR. Microsatellite PCR products were confirmed by agarose gel electrophoresis and separated for genotyping in polyacrylamide gel electrophoresis. Eight of the nine studied microsatellites were polymorphic, and generated a total of nine allelic profiles for the nice loci among adult worm samples, and 12 allelic profiles for the six loci that amplified both types of samples. Each geographical region (Santarém and Coimbra Districts), for blood samples, presented allelic diversity. In summary, the studied microsatellite markers, and as analysed here in polyacrylamide gels, can be considered more informative for population diversity studies of D. immitis in Portugal than ITS2 sequencing.