Aplicação de antigénio larvar de Toxocara canis no imunodiagnóstico da toxocarose humana

Abstract

A toxocarose humana é uma zoonose helmíntica de distribuição mundial, causada pela infeção de larvas no segundo estádio (L2) de Toxocara spp. e outros nemátodes da ordem Ascaridida, podendo desencadear, entre várias síndromes clínicas, a toxocarose visceral ou larva migrante visceral (LMV). O Homem, hospedeiro paraténico destes nemátodes, não elimina qualquer forma parasitária, tornando o diagnóstico desta zoonose dependente de uma combinação de sintomas suportados por uma serologia positiva e história epidemiológica. O método de referência no imunodiagnóstico da toxocarose baseia-se no uso de kits comerciais de micro-ELISA, que utilizam antigénios de excreção/secreção de larvas L2 de T. canis (Ag E/S) na deteção de anticorpos IgG anti-Toxocara spp. no soro humano. Embora de elevada sensibilidade, este método apresenta como desvantagens a ocorrência de reações cruzadas com anticorpos induzidos por outras infeções helmínticas, bem como o custo associado à sua aquisição. O objetivo deste estudo foi a obtenção de um método serológico sensível, específico e de custo reduzido, facilmente aplicável em rotina. Considerando que, à semelhança do que acontece com outros parasitas, a componente lipídica presente no antigénio de larvas L2 de T. canis poderá estar na origem das reações cruzadas entre helmintas, procedeu-se à obtenção de antigénio deslipidizado (AgDs). Avaliou-se a sensibilidade e especificidade do AgDs produzido in house de larvas L2 de T. canis no imunodiagnóstico da LMV pelo método de micro-ELISA, através da deteção de anticorpos IgG e IgG4, em comparação com o método de referência utilizado no laboratório de Helmintologia do Instituto de Higiene e Medicina Tropical, o kit Toxocara canis IgG-ELISA, Bioactiva Diagnostica (kit ELISA-IgG®). Foram testados 142 soros de indivíduos com suspeita de LMV, 25 de indivíduos com outras helmintoses e 6 de indivíduos normais. Os resultados demonstraram uma concordância significativa do AgDs com o kit ELISAIgG ®, apenas na deteção de anticorpos IgG anti-Toxocara spp. (Kappa=0,168; pvalue< 0,05). A sensibilidade do AgDs foi inferior à do kit ELISA-IgG®, sendo de 42,9% e de 22,6% na deteção de anticorpos IgG e IgG4, respetivamente. A especificidade foi inferior à do kit ELISA-IgG® na deteção de anticorpos IgG (72% e 76%, respetivamente), no entanto foi superior na deteção de IgG4 (80%) em relação ao kit. O menor número de resultados falsos positivos verificados com este isótipo, em comparação com a IgG, corrobora estudos publicados acerca do seu valor no imunodiagnóstico desta e de outras helmintoses. A infeção foi predominante no sexo masculino (60,7%), verificando-se diferenças estatisticamente significativas apenas com o kit ELISA-IgG® (χ2, p≈0,008 <0,05) em relação ao género. Quanto ao grupo etário, a distribuição da infeção foi predominante nos indivíduos com idade inferior a 10 anos (em todos os testes de micro- ELISA), mas as diferenças não apresentaram significado estatístico relativamente aos grupos de idade superior. Neste estudo, a especificidade do kit ELISA-IgG® foi inferior à descrita pelo fabricante, registando reações cruzadas com soros de indivíduos com filariose, schistosomose e fasciolose, realçando a fragilidade dos métodos aplicados em rotina bem como a necessidade de investigação, sobretudo com vista à obtenção de preparações antigénicas de maior especificidade.

Human toxocarosis is a worldwide helminthic zoonosis caused by infection of Toxocara spp. second stage larvae (L2) and other nematodes of Ascaridida order. It may trigger, among several clinical syndromes, visceral toxocarosis or visceral larva migrans (VLM). As humans are paratenic hosts, the parasite is unable to achieve the adult stage, making diagnosis highly dependent of a combination of symptoms supported by positive serology and epidemiological history. The reference method for toxocarosis immunodiagnosis is based on commercial micro- ELISA kit using T. canis L2 excretory/secretory antigens (E/S Ag) in the detection of IgG anti-Toxocara spp. antibodies in human serum. Despite its high sensitivity, the test presents some disadvantages, namely, the occurrence of cross-reactions with antibodies generated by other helminth infections, as well as the cost of the kits. The aim of this study was to obtain a sensitive, specific and low cost serological method, easily applicable for routine VML diagnosis. Considering that, similarly to other parasites, the lipid component of T. canis L2 larvae antigens may be responsible for crossreactions with other helminths, we produced a delipidized antigen (AgDs) from T. canis L2 larvae. The sensitivity and specificity of a micro-ELISA test using AgDs for IgG and IgG4 anti- Toxocara antibody detection was evaluated in the immunodiagnosis of VLM, as compared with the reference commercial kit ELISA-IgG® (Bioactiva Diagnostica), used in the laboratory of Medical Helminthology of the Instituto de Higiene e Medicina Tropical. In total, 142 sera from suspected VLM individuals, 25 from individuals with other helminthiasis and 6 from non-infected controls were tested. It was observed a significant level of agreement (Kappa=0,168; p-value<0,05). between AgDs and ELISA-IgG® kit, only for detection of anti-Toxocara spp. IgG antibodies. The sensitivity of AgDs micro-ELISA was lower than the ELISA-IgG® Kit, 42.9% and 22.6% in the detection of IgG and IgG4 antibodies, respectively. The specificity was lower than the ELISA-IgG® kit in the detection of IgG antibodies (72% and 76%, respectively), however it was higher for IgG4 (80%). The lower number of false positive results with this isotype compared with IgG results corroborates previous studies about the usefulness of IgG4 in the immunodiagnostic of this and other helminthiasis. VLM infection was predominant in males (60.7%), but significant statistical differences between genders were only found with the ELISA-IgG® kit (χ2, p≈0,008 <0,05). Concerning age groups, infection was predominant in subjects younger than 10 years old (in all micro-ELISA tests), but the differences were not statistically significant comparing to the higher age groups. In this study, the ELISA-IgG® kit specificity was lower than that described by the manufacturer, registering cross-reactions with sera from individuals with filariasis, schistosomiasis and fascioliasis, emphasizing some limitations of the methods applied in lab routine, as well as the need for further research, especially targeting antigenic preparations with greater specificity.