Inibidores de prenilação como uma nova estratégia terapêutica de tratamento da infeção por HDV

Abstract

O vírus da hepatite delta (HDV) é o agente responsável pela forma mais severa e mortal de hepatite viral. O HDV co-infeta ou super-infeta hepatócitos previamente infetados pelo vírus da hepatite B (HBV), aumentando o risco de desenvolvimento de cirrose, carcinoma hepatocelular (CHC) e hepatite fulminante. A associação clínica entre estes dois vírus é justificada pelo facto do invólucro externo do HDV ser constituído pelas proteínas de superfície do HBV (HBsAgs). O genoma do HDV é constituído por uma única molécula de RNA circular de cadeia simples, que codifica uma única proteína, o antigénio delta (HDAg). A ocorrência de um mecanismo de editing do RNA, resulta na expressão de duas formas do HDAg, a pequena (S-HDAg) e a grande (L-HDAg). Estas duas proteínas virais desempenham funções várias no ciclo do HDV, enquanto que o S-HDAg estimula a replicação do RNA viral, o L-HDAg é responsável pela interação com os HBsAgs para formar partículas virais. Tendo em conta a inexistência de uma terapia disponível para a hepatite delta, é essencial o desenvolvimento de novas terapêuticas mais eficazes e seguras. A necessidade de encontrar novas opções terapêuticas levou ao desenvolvimento de fármacos dirigidos a moléculas específicas relevantes no ciclo do vírus delta. Este é o caso do mecanismo de prenilação do L-HDAg, catalisado por enzimas celulares do grupo das farnesil-transferases. Desta forma, inibidores desta enzima celular poderão constituir uma abordagem terapêutica promissora da infeção provocada por HDV. A necessidade de encontrar novas opções terapêuticas, levou-nos a desenvolver um estudo em que se avaliou o potencial terapêutico dos inibidores de farnesil-transferases tais como FTI-277, compostos A e B nas células da linha celular Huh7D12, avaliando o impacto em termos de viabilidade celular e correlacionando a capacidade dos fármacos de intervir nos níveis de expressão do genoma viral do HDV. Avaliamos ainda a ação destes inibidores sobre a expressão de oncogenes associados ao desenvolvimento de CHC. Para tal, as células Huh7D12 foram incubadas com concentrações crescentes de FTI-277, composto A e B durante 48h. A viabilidade celular foi testada utilizando o CellTiter-Blue® Cell Viability Assay Kit e os níveis de expressão do RNA genómico do HDV e de oncogenes (STAT3, NF-kB, PIM1, BMP5, CDK2) através da reação de PCR utilizando um par de primers específicos. A análise dos efeitos em termos de viabilidade celular demonstrou que os compostos A e B são menos tóxicos para as células da linha celular Huh7D12 do que o inibidor comercial FTI-277 face às mesmas concentrações de fármaco. Verificou-se também que os compostos A e B, tal como o fármaco comercial FTI-277, apresentam o mesmo efeito sobre a expressão do RNA genómico do HDV e os oncogenes STAT3 e NF-kB, porém com menor interferência na viabilidade celular, o que pode contribuir para melhorar a eficácia terapêutica com diminuição da toxicidade e dos efeitos secundários. Os resultados obtidos neste trabalho mostraram que os fármacos dirigidos a farnesil-transferases celulares podem constituir uma nova abordagem terapêutica promissora no tratamento da hepatite delta crónica e como supressores de processos cancerígenos.

Hepatitis delta virus (HDV) is the causative agent of one of the most severe forms of viral hepatitis. HDV occurs either coinfection or as superinfection in patients with pre-existing hepatitis B virus (HBV) infection and increases the risk and rapid progression to cirrhosis, hepatocellular carcinoma (CHC) and fulminant liver failure. The clinical association between these two viruses is justified by the fact that the envelope of HDV is composed by hepatitis B surface antigens (HBsAgs). The HDV genome is a circular single-stranded RNA molecule, which encodes a single protein called the delta antigen (HDAg). The occurrence of an RNA editing mechanism results in expression of the two delta antigen isoforms, the small (S-HDAg) and the large (L-HDAg). Both forms of these viral proteins are importante for distinct steps within the HDV life cycle, whereas the S-HDAg supports HDV replication, the L-HDAg interact with HBsAg to assemble new virions. At this time there is no available therapy for hepatitis delta, wich make necessary the development of new, more effective and safe therapies. The need to find new therapeutic options led to the development of drugs targeting specific molecules in the delta virus cycle. This is the case of the prenylation mechanism of L-HDAg, catalyzed by cellular enzymes of the farnesyltransferase group. In this way, inhibitors of this cellular enzyme may constitute a promising therapeutic approach to HDV-induced infection. The need to find safe and efficient therapeutic options, led us to develop a study to evaluate the therapeutic potencial of farnesyltransferase inhibitors, such as the FTI-277, compounds A and B in a Huh7D12 cell line. We evaluated the impact in term of cell viability and correlated the ability of these drugs to intervene in the expression of the HDV viral genome. We also evaluated the action of these inhibitors on the expression of oncogenes associated with the development of CHC. For this purpose, Huh7D12 cells were incubated for 48 hours with rising concentrations of FTI-277, compounds A and B. Cellular viability was assessed by use the CellTiter-Blue® Cell Viability Assay Kit and the expression levels of HDV genomic RNA and oncogenes (STAT3, NF-kB, PIM1, BMP5, CDK2) by the PCR reaction using the specific primers. Analysis of effects in terms of cell viability has shown that compounds A and B are less toxic to cells on Huh7D12 cell line than the commercial inhibitor FTI-277 at the same drug concentrations. Compounds A and B, like the commercial drug FTI-277, have also been shown to have the same effect on the HDV genomic RNA and on the oncogenes STAT3 and NF-kB, but with less interference in cell viability, which may contribute to improving therapeutic efficacy with decreased toxicity and side effects. The results obtained in this work, showed that the farnesyltransferase inhibitors used in this study may constitute a promising new therapeutic approach in the treatment of chronic delta hepatitis and as suppressors of carcinogenic processes.