Genetic engineering of mammalian cell lines for improved production of gene therapy viral vectors

Abstract

Viral vectors are widely used in gene therapy as vehicles to deliver therapeutic gene cargos. Among the different viral vectors, retroviral and lentiviral vectors are of particular interest due to their ability to sustain long-term stable expression of the therapeutic gene. However, current production systems for these vectors face several challenges namely, the low yields and the need of animal blood serum. This work focused on improving retroviral vector production by genetic engineering targeting glutathione and lipid metabolic pathways. To this end, molecular and analytical tools were also developed, namely, a system for inducible gene expression and a method for universal titration of lentiviral vectors. The inducible system, based on a TET-ON configuration, uses a tetracycline analogue to induce dose-responsive expression of the gene of interest and was used as a molecular tool for genetic manipulation. The lentiviral vector titration method is based on the quantification of lentiviral long terminal repeats (LV-LTR) integrated into the target cells genome. In the context of this work, it allowed to titrate lentiviral vector stocks containing the inducible system, assuring the populations were uniformly established. Genetic manipulation of glutathione metabolism was able to increase retroviral vector production up to 5-fold. This effect was associated with increased retroviral transgene expression and copy number in the producer cells. Lipid metabolism was studied in two producer cell lines that displayed different phenotypes regarding retroviral vector production under serum deprivation, to guide further genetic engineering. This work contributes to the state-of-the-art on gene therapy based on improvement of viral vector producer cell lines by means of metabolism manipulation. The novel tools also developed expand the boundaries of genetic engineering and cell line development.

Os vetores virais são amplamente usados em terapia génica como veículos de entrega de material genético. Entre os diferentes tipos de vetores virais, os vetores retrovirais e lentivirais são particularmente interessantes pois permitem uma expressão estável e a longo-termo do gene terapêutico. No entanto, os atuais sistemas de produção destes vetores enfrentam dificuldades, nomeadamente a nível dos títulos de produção e a sua dependência de soro animal. Este trabalho focou-se na melhoria da produção de vetores retrovirais através de engenharia genética nas vias metabólicas da glutationa e dos lípidos. Para isso, foram desenvolvidas ferramentas moleculares e analíticas nomeadamente, um sistema indutível de expressão génica e um método universal para titulação de vetores lentivirais. O sistema indutível, baseado numa configuração TET-ON, é ativado por um análogo da tetraciclina, levando a uma expressão do gene de interesse proporcional à dose aplicada e foi por isso usado como ferramenta molecular para manipulação genética. O método universal para titulação de vetores lentivirais baseia-se na quantificação das long terminal repeats lentivirais (LV-LTR) integradas no genoma das células-alvo. No contexto deste trabalho, permitiu a titulação de preparações de vetores lentivirais usadas para entregar as construções do sistema indutível, de forma a estabelece populações uniformes. A manipulação genética do metabolismo da glutationa levou ao aumento da produção de vetores retrovirais até 5 vezes. Este efeito foi acompanhado de aumento da expressão e do número de cópias do transgene retroviral nas células produtoras. O metabolismo lipídico foi estudado em duas linhas celulares produtoras que manifestaram diferentes fenótipos no que toca à produção de vetores retrovirais, guiando futuras abordagens de engenharia genética. Este trabalho contribui para o estado-da-arte da terapia génica através do melhoramento de células produtoras de vetores virais recorrendo à manipulação metabólica. As novas ferramentas desenvolvidas expandem as aplicações da engenharia genética e do desenvolvimento de linhas celulares.