Retinopatia diabética: uma doença neurodegenerativa antes de uma doença vascular?

Abstract

RESUMO: A Diabetes Mellitus (DM) é uma das doenças crónicas mais comuns em quase todos os países do mundo e constitui um problema crítico de saúde pública, sendo inclusivamente considerada uma pandemia do século XXI. Enquanto a prevalência estimada para 2013 foi de 382 milhões de pessoas, em 2015 415 milhões de pessoas viviam com DM e espera-se que em 2035 a DM afete 592 milhões de Pessoas a nível mundial. Destes valores, a DM tipo 2 representa 90 a 95% da população diabética. Em Portugal, em 2014 a prevalência estimada de DM na população com idades compreendidas entre os 20 e os 79 anos (7.7 milhões de indivíduos) foi de 13.1%. Dos 415 milhões de pessoas com DM a nível mundial registados em 2015, mais de um terço irá desenvolver alguma forma de retinopatia diabética (RD) ao longo da vida. A RD é a principal causa de novos casos de cegueira legal entre os americanos em idade laboral. Nos EUA, a prevalência de RD em adultos com mais de 40 anos é de 3.4% (4.1 milhões de pessoas), sendo a prevalência de retinopatia que ameaça a visão de 0.75% (899 mil pessoas). Assumindo, neste país, uma prevalência semelhante à descrita, os números projetados para 2020 seriam de 6 milhões de pessoas com RD e 1.34 milhões de pessoas com possível cegueira por RD. Em Portugal, o estudo RETINODIAB Identificou uma prevalência de RD de 16.3%, isto é, 8584 doentes e uma incidência de RD de 4.60% no primeiro ano e de 3.87% no quinto ano, com uma incidência cumulativa aos 5 anos de 14.47%. Atualmente, a Classificação Clínica Internacional da RD subdivide-a em diferentes estadios conforme as alterações microvasculares observáveis à fundoscopia, definindo que os doentes sem estas características não apresentavam RD. No entanto, diferentes estudos em modelos animais e post-mortem têm identificado que, para além da RD ser uma doença microcirculatória da retina, é também uma patologia neurodegenerativa. Este conceito foi pela primeira vez introduzido por Barber et al., que verificou que após induzir o desenvolvimento de diabetes em ratos, estes apresentavam uma elevada taxa de apoptose da neurorretina sem qualquer apoptose das células endoteliais. Outros estudos em modelos experimentais demonstraram ainda que para além desta apoptose das células ganglionares da retina, dos fotorrecetores e do epitélio pigmentado da retina, outra característica da neurodegeneração retiniana é a ativação glial. Para além disto, alterações vasculares a nível da coróide, idênticas às da retina, foram identificadas em estudos histológicos, mesmo antes do aparecimento de lesões vasculares fundoscopicamente observáveis, não se conhecendo ainda qual a importância temporal desta estrutura para o aparecimento da RD. Apesar de conhecermos as características de neurodegeneração descritas, estas ainda não foram integradas na prática clínica. Mesmo com os novos avanços tecnológicos na avaliação da RD, esta continua a basear-se nas alterações vasculares fundoscópicas. Recentemente, a tomografia de coerência ótica (OCT) tem sido introduzida na prática clínica como um dos métodos não invasivos e objetivos para visualizar a retina, mostrando os seus detalhes como se de um exame histológico se tratasse. Ultimamente, através de software de segmentação, tem sido possível fazer uma análise quantitativa e qualitativa das espessuras de todas as camadas da retina e da coróide. Assim, o objetivo deste projeto foi identificar alterações retinianas e coroideias em doentes diabéticos sem RD pela sua comparação com indivíduos não diabéticos e, posteriormente, fazer o seguimento destes doentes diabéticos ao longo de um ano de forma a identificar como as referidas alterações estruturais se comportam com o tempo. Foi definido ainda como objetivo secundário verificar qual a associação das alterações das camadas da retina e coróide dos doentes diabéticos com fatores demográficos (idade e género), sistémicos (duração da diabetes, pressão arterial média (PAM), glicemia e hemoglobina glicada (HbA1c) e hábitos farmacológicos) e oculares (pressão intraocular (PIO), amplitude de pulso ocular (APO), equivalente esférico e comprimento axial). Foi planeado um estudo longitudinal com a maior série publicada sobre o tema até à data, para o qual foram recrutados 175 doentes (125 doentes diabéticos tipo 2 sem RD e 50 indivíduos não diabéticos). Todos os doentes foram submetidos, numa primeira visita V1, a uma avaliação oftalmológica completa com a realização de Spectral Domain (SD)-OCT com e sem software enhanced depth imaging (EDI). A espessura da coróide foi avaliada manualmente em 13 localizações (subfoveal e 3 medições com intervalos de 500 μm em 4 direções – nasal, temporal, superior e inferior). Após segmentação automática, a espessura de cada camada da retina (8 camadas individualizadas e a espessura da retina total - RT) foi calculada nas 9 áreas Early Treatment Diabetic Retinopathy Study (ETDRS). Após um ano de seguimento, todos os doentes diabéticos foram novamente convocados para uma nova visita V2 onde foram submetidos aos mesmos exames já referidos. Em comparação com os indivíduos não diabéticos, apesar da ausência de significância estatística, verificou-se nos doentes diabéticos sem RD uma tendência para a espessura da coróide ser superior em todas as localizações (entre 6.16 e 24.27 μm). A espessura da coróide associou-se de forma negativa com a idade (p < 0.001) em ambos os grupos, assim como de forma positiva com a APO, mas só no grupo de doentes diabéticos (por cada mmHg de aumento da APO a espessura da coróide aumentou, em média 8.5 a 11.6 μm). Relativamente à análise das diferentes camadas da retina, os doentes diabéticos foram classificados de acordo com a duração da diabetes em três grupos: grupo I (< 5 anos, n=55), grupo II (5–10 anos, n=39), e grupo III (>10 anos, n=31). No grupo I e III, em 6 áreas ETDRS, foi identificada uma diminuição da espessura da camada de fotorrecetores (FR) quando comparada com a dos indivíduos não diabéticos, (p < 0.0007). Os doentes com duração de doença moderada (grupo II) apresentaram valores de FR superiores ao grupo I e III. Interessantemente, doentes com doença há mais tempo (grupo III) tiveram os menores valores de FR. Não se identificaram diferenças significativas nos restantes parâmetros retinianos. Após um ano de seguimento, dos 125 doentes, 103 completaram o estudo (attrition rate de 17.6%) e 9 desenvolveram RD (8.7%). A espessura da coróide manteve a sua tendência crescente, apresentando na visita V2 valores superiores (entre 10.01 e 17.34 μm) relativamente à visita V1 (p < 0.001 a 0.003). Por outro lado, no que diz respeito à retina, as espessura das camada de células ganglionares (CCG) (setores I3 e N6), camada plexiforme interna (CPI) (setores S6 e N6), camada nuclear interna (CNI) (setores T6 e N6), camada plexiforme externa (CPE) (setor S6) e espessura da RT (setores S3, I3, N3, S6 e T6) foram menores na V2 que na V1 (p < 0.001). Nesta V2, a espessura RT diminuiu, em média, entre 1.74 e 3.26 μm, nos doentes diabéticos independentemente de terem desenvolvido RD. Na análise relativa aos doentes que desenvolveram RD, observou-se, que estes tinham valores de espessura da coróide menores em relação aos doentes sem RD (230.28 a 280.10 μm versus 217.00 a 269.56 μm), no entanto, sem significado estatístico. Neste grupo também se verificou que a RD se encontrou associada de forma negativa com a espessura de RT (setores central, S3, T3, I3 e N3; p = 0.004 a 0.024), da camada nuclear externa (CNE) (setores T6 e I6; p = 0.007 e 0.009) e camada de FR (setor N6; p = 0.038). A espessura da RT diminuiu entre 13.04 e 16.63 μm nos doentes com presença de RD. Em conclusão, os doentes diabéticos sem RD têm menores espessuras significativas de FR e uma tendência para uma maior espessura da coróide comparativamente com os indivíduos não diabéticos. Possivelmente, sendo a coróide um tecido vascular, que ao contrário dos vasos retina, apresenta uma capacidade de autorregulação controversa, é afetada mais precocemente do que esta última. Também o padrão de associações da espessura da coróide, diferente nos dois grupos, leva-nos a supor a presença de sinais de coroidopatia diabética já identificada em estudos histológicos mesmo em doentes diabéticos sem RD. Após esta fase de aumento da espessura da coróide, que eventualmente traduz edema e extravasamento vascular, verificouse que os doentes diabéticos que desenvolvem RD apresentaram valores de espessura coroideia menores, traduzindo a fase atrófica deste tecido abundantemente vascular. Por outro lado, na visita V1 foi verificado que a camada retiniana que mais precocemente se encontra afetada, e diminuída face aos indivíduos não diabéticos, é a camada dos FR. Esta é a camada de células mais metabolicamente ativas, e ao contrário das camadas mais internas, é nutrida pela coróide. Encontrando-se a coróide precocemente alterada a camada de FR por consequência também apresentará alterações. Outra causa possível para a perda dos FR, pode ser o efeito direto da hiperglicemia e hipoinsulinemia. A DM provoca alterações na via de sinalização da insulina nos FR, originando defeitos na via da neuroprotecção dos mesmos. Um dos resultados mais interessantes deste estudo foi o padrão não uniforme de menor espessura da camada de FR de acordo com a duração da diabetes. Esta observação pode ser explicada por um edema celular temporário devido à hipoxia induzida pela diabetes que por sua vez origina stress oxidativo com aumento da produção de superóxido e outras espécies reativas de oxigénio (ROS) a nível da retina. As ROS induzem a libertação de um conjunto de moléculas pró-inflamatórias, a sintetase do óxido nítrico (NOS) e a molécula de adesão intercelular 1 (ICAM-1), com consequente alteração a nível dos vasos retinianos e do espaço extravascular. Por fim, a este contínuo edema celular seguir-se-ia um processo atrófico explicando, assim, a menor espessura da camada de FR encontrada no grupo de doentes diabéticos com DM há mais anos (grupo III). Este comportamento não linear é importante para poder explicar alguns resultados contraditórios de diferentes estudos desta área, uma vez que cada um deles pode recrutar doentes com diferentes durações de diabetes. Os doentes diabéticos ao fim de 1 ano de seguimento revelaram diminuição significativa não só da espessura da RT assim como de alguns setores das camadas internas, independentemente de terem desenvolvido RD. Quando observamos os doentes que desenvolveram RD verificamos uma maior diminuição da espessura de RT e FR. Estas alterações estruturais podem corresponder a uma fase precoce da RD, de neurodegeneração e ser potencialmente importantes para identificar quais os doentes em risco de desenvolver RD. As limitações deste estudo devem-se particularmente a falhas metodológicas e inerentes à maioria dos estudos que incluem doentes diabéticos tipo 2. Uma das limitações diz respeito à duração da doença, uma vez que o seu início (particularmente DM tipo 2) é insidioso e os doentes só o podem relatar após o diagnóstico feito com base nos achados clínicos e analíticos. Desta forma, a duração da doença pode ter sido subestimada. Quanto à metodologia, as medições da espessura da coróide foram realizadas manualmente. Contudo, esta segmentação manual tem demonstrado elevada reprodutibilidade intra e interobservador. A avaliação da espessura da retina foi realizada com um software automático. No entanto, quando foram encontrados erros nesta segmentação automática, foi realizada a correção manual, por um oftalmologista desconhecedor do diagnóstico dos doentes. Relativamente à análise da espessura da coróide, o estado de hidratação e o índice de massa corporal (IMC) não foram tidos em conta. Foi tido em conta a variabilidade circadiana realizando todos os exames à mesma hora do dia e no mesmo ambiente. Os recentes estudos relativos ao IMC são controversos. Desta forma, o IMC deve ser incluído em estudos futuros na tentativa de eliminar este fator de confundimento. A análise da retina teve outra limitação que se prende com a subdivisão da amostra em grupos, de acordo com a duração da doença, que pode dificultar a capacidade de subavaliar as diferentes espessuras da retina, apesar de este ser um dos maiores estudos nesta área – 125 doentes sem RD. Ainda assim, a análise dos subgrupos foi muito interessante e fornece uma nova base para futuros estudos. Mais ainda, uma das vantagens deste trabalho foi a criação de uma base de dados que permitirá, através da interdisciplinaridade de diferentes áreas e departamentos nacionais e internacionais, o aparecimento de novas linhas de investigação. Uma delas poderá incidir sobre a determinação de valores preditivos das diferentes camadas da retina e coróide que nos ajudem a identificar quais os doentes diabéticos em risco de desenvolver RD. Outra vertente possível será a complementação desta análise estrutural com estudos de ciência básica, de forma a identificar quais as variáveis biológicas que interferem na análise e que hoje não são conhecidas. Finalmente, o culminar destes trabalhos poderá eventualmente conduzir a uma possível revisão da própria classificação da RD e ainda servir de base a estudos farmacológicos já existentes no âmbito da neuroprotecção.

ABSTRACT: Diabetes Mellitus (DM) is one of the most common chronic diseases in the world and is a critical public health problem that could even be considered a pandemic. While the estimated prevalence for DM in 2013 was 382 million people, in 2015 415 million people were living with diabetes and this number is expected to rise up to 592 million people worldwide in 2035. 90 to 95% of the diabetic population has type 2 DM. In 2014 the estimated prevalence of DM in the Portuguese population aged between 20 and 79 years old (7.7 million individuals) was 13.1%. Of the 415 million diabetic patients worldwide in 2015 more than one-third will develop some form of diabetic retinopathy (DR). DR is the leading cause of legal blindness among Americans of working age. The prevalence of DR in adults over 40 years in the US is 3.4% (4.1 million people), and the prevalence of retinopathy that threatens vision is 0.75% (899 000 people). Assuming a similar prevalence of DM, the estimated numbers for 2020 would be 6 million people with DR and 1.34 million people with possible blindness caused by DR. In Portugal, the RETINODIAB study identified a prevalence of DR of 16.3% (8584 patients) and a DR incidence of 4.60% in the first year and 3.87% in the fifth year, with a cumulative incidence at 5 years of 14.47%. The International Clinical Classification of DR divides this pathology in different stages according to fundus microvascular changes. Therefore, it states that patients without these changes do not have DR. However, studies in different animal models or post-mortem have proved that DR is not only a microcirculatory disease of the retina but also a neurodegenerative disease. This concept was first introduced by Barber et al. that found that after inducing diabetes in mice, they exhibited a high rate of neuroretinal apoptosis without endothelial cell apoptosis. Other studies have shown, in experimental models that in addition to apoptosis of retinal ganglion cells, photoreceptors, retinal pigment epithelium and retinal neurodegeneration, glial activation is also present. Moreover, changes in the vascular choroid similar to the retina were found in histological studies even before the onset of observable vascular lesions. The chronological importance of the changes of this structure for the appearance of DR still has to be further explored. Although neurodegeneration features of this disease have been described, they still have not been included in the clinical practice. Even the new technological advances in DR evaluation continue to be based upon the assessment of vascular changes. Recently, optical coherence tomography (OCT) has been introduced in clinical practice as a noninvasive and objective method to study the retina, showing its details with a resolution similar to a histological examination. More recently, with the segmentation software a quantitative and qualitative analysis of the thicknesses of all retinal and choroidal layers are now possible. The aim of this project was to identify retinal and choroidal changes in diabetic patients without DR by comparison with non-diabetic subjects and then to follow up these diabetic patients over a year to identify how these structural differences change with time. A secondary objective that was established was to evaluate the association of changes in retinal layers and choroid of diabetic patients with demographic (age and gender), systemic (duration of diabetes, mean arterial pressure (MAP), blood glucose and glycated hemoglobin (HbA1c), drug habits) and ocular factors (intraocular pressure (IOP), ocular pulse amplitude (OPA), spherical equivalent and axial length). A longitudinal study with the largest sample published to date was planned, for which 175 patients were recruited (125 type 2 diabetic patients without DR and 50 non-diabetic subjects). All patients were submitted, in a first visit V1, to a complete ophthalmologic evaluation with Spectral Domain (SD) -OCT with and without software enhanced depth imaging (EDI). Choroidal thickness was manually evaluated in 13 locations (subfoveal and 3 measurements with intervals of 500 μm in 4 directions - nasal, temporal, superior and inferior). After automatic segmentation, the thickness of each retinal layer (8 individual layers and the thickness of the overall retinal-RT) was calculated in the 9 areas Early Treatment Diabetic Retinopathy Study (ETDRS). After a year of follow-up, all diabetic patients were observed again in a new visit V2 and were evaluated in the same way as mentioned above. In comparison with non-diabetic subjects, despite the lack of statistical significance, it was found that in diabetic patients without DR there is a tendency for the choroidal thickness to be increased in all locations (between 6.16 and 24.27 μm). Choroidal thickness was negatively associated with age (p < 0.001) in both groups, and positively with OPA, but only in the diabetic group (for each mmHg increase in OPA, choroidal thickness increased on average, between 8.5 and 11.6 μm.) For the analysis of the different retina layers, diabetic patients were classified according to duration of diabetes into three groups: group I (<5 years, n = 55), group II (5-10 years, n = 39), group III (> 10 years, n = 31). In groups I and III, in 6 ETDRS areas, a decrease in the thickness of the photoreceptors layer (PR) was identified when compared with non-diabetic subjects (p < 0.0007). Moreover, patients with moderate disease duration (group II) showed higher PR values than group I and III. Interestingly, patients with longer disease duration (group III) had the lowest PR values. No significant differences were identified in other retinal parameters. After a year of follow-up, from the 125 patients, 103 completed the study (attrition rate of 17.6%) and 9 developed DR (8.7%). The choroidal thickness maintained its upward trend, with higher values in visit V2 (between 10.01 and 17.34 μm) than visit V1 (p < 0001-0003). On the other hand, in the retina, the thickness of the ganglion cell layer (GCL) (I3 and N6 sectors), inner plexiform layer (IPL) (S6 and N6 sectors), inner nuclear layer (INL) (T6 and N6 sectors), outer plexiform layer (OPL) (S6 sector) and thickness of the RT (S3 sectors, I3, N3, S6 and T6) were lower in V2 than in V1 (p <0.001). In V2, the RT thickness decreased on average between 1.74 and 3.26 μm in diabetic patients regardless of whether they developed DR or not. The patients who developed DR had smaller choroidal thickness values compared to patients without DR (230.28 to 280.10 μm versus 217.00 to 269.56 μm) but without statistical significance. In this group, DR was associated negatively with the RT thickness (central sectors S3, T3 I3 and N3, p = 0.004-0.024), ONL (T6 and I6 sectors; p = 0.007 and 0009) and PR layer (N6 sector, p = 0.038). The presence of DR was associated with a decreased of the RT thickness of 13.04 to 16.63 μm. In conclusion, diabetic patients without DR have smaller PR layer thicknesses and a trend for a greater choroidal thickness when compared with non-diabetic subjects. Choroid is a vascular tissue that unlike the retinal vessels, has a controversial auto-regulation, and can possibly turn out to be affected earlier than the retina. Moreover, the fact that the pattern of associations of choroidal thickness is different in the two groups, can lead us to suppose the presence of diabetic choroidopathy signals already identified in histological studies even in diabetic patients without DR. After this phase of increased choroidal thickness, which possibly reflects swelling and vascular leakage, it was found that diabetic patients that develop DR begin to have lower choroidal thickness, similar to an atrophic phase of this vascular tissue. On the other hand, in the visit V1 it was determined that the retinal layer that is affected earlier and decreased compared to non-diabetic subjects is the photoreceptor layer. This layer has the most metabolically active cells and is nourished by the choroid. As the choroid layer is earlier affected, the PR layer will therefore also present changes. Another possible cause for the loss of PR can be the direct effect of hyperglycemia and hypoinsulinemia. DM causes changes in the insulin signaling pathway in PR, causing defects in neuroprotection pathways. One of the most interesting results from this study was the non-uniform pattern of decreased PR layer thickness according to the duration of diabetes. This observation may be explained by a temporary cell edema due to various reasons. Hypoxia-induced diabetes lead to oxidative stress with increased superoxide production and other reactive oxygen species (ROS) within the retina, which induce the release of pro-inflammatory molecules, nitric oxide synthase (NOS) and intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1), and cause changes in the retinal vessels and extravascular space. Finally, this continuous cellular edema instigates atrophy that can explain the thinner PR layer found in the group of diabetic patients with DM of longer duration (group III). This non-linear behavior is important to understand some contradictory results of different studies in this area, since patients with different diabetes disease duration may be recruited. Diabetic patients at 1 year follow-up showed a significant decrease in the thickness of overall retina as well as in some sectors of the inner layers, regardless of the development of DR. Patients who developed DR present a persistence of the decrease in the thickness of RT and PR. These structural changes may correspond to an early phase of DR, neurodegeneration, and might be important to identify patients at risk of developing DR. The limitations of our study are determined by methodological problems inherent to most studies that include type 2 diabetic patients. Therefore, one of the limitations is related with the duration of the disease, since its beginning (particularly in type 2 diabetes) is insidious and patients can only report it after the diagnosis is made based on clinical and laboratory findings. Thus, the duration of the disease may have been underestimated. Looking at the methodological limitations, measurements of the choroidal thickness were performed manually. However, this manual segmentation has been proved to have a high intra and interobserver reproducibility. Assessment of retinal thickness was performed with an automated software. However, when the automatic segmentation obtained was inaccurate, an ophthalmologist carried out manual correction unaware of the patient’s diagnosis. For the analysis of choroidal thickness, hydration status and body mass index (BMI) were not taken into account. However, circadian variability was limited by performing all tests at the same time of day and in the same environment. Recent studies on BMI are controversial. Thus, the BMI should be included in future studies in an attempt to eliminate this possible confounding factor. Retinal analysis had also another limitation related to the fact that although this is one of the largest studies in this area - including 125 patients without DR, by subdividing the sample into groups according to the duration of the disease, the ability to underestimate the different retinal thickness may have been hampered. Even so, subgroup analysis was very interesting and provides a new basis for future studies. Furthermore, one of the advantages of this work was to create a database, which in the future can contribute for new lines of research with possible national and international interdisciplinary approaches. One of them can focus on determining the predictive value of the different layers of the retina and choroid to help in the identification of diabetic patients at risk of developing DR. Another possible feature would be the backing of this structural analysis with basic science studies in order to identify the biological variables that interfere with the analysis and that are still unknown. Ultimately, this work could eventually lead to a possible revision on the classification of RD and support pharmacological studies already being performed on neuroprotection.