Advances in Arbovirus Detection: Targeting Animal Samples

Abstract

Arboviruses pose significant threats to public and animal health, with their incidence and geographic range expanding under the influence of climate change, global mobility, vector sustainability and ecological shifts. Portugal, situated along the Mediterranean coastline and at the intersection of Afro-Eurasian avian migratory routes, is particularly vulnerable to incursions of zoonotic arboviruses such as West Nile virus (WNV), Usutu virus (USUV), Bagaza virus (BAGV), Sindbis virus (SINV), Tick-borne encephalitis virus (TBEV), and Crimean-Congo haemorrhagic fever virus (CCHFV). This study aimed to advance arboviral surveillance in mainland Portugal through a two-staged approach. First, a broad molecular screening of diverse animal matrices through specific RT-qPCRs was conducted to detect genomic material from the mentioned arboviruses (along with Western equine encephalitis virus (WEEV)). Second, equine sera collected between 2022 and 2024 that had tested positive for WNV-specific IgM by ELISA underwent virus neutralization assays to quantify the neutralizing antibodies and visualize temporal trends. Even though we were unable to molecularly detect USUV, BAGV, TBEV, SINV, WEEV and CCHFV, our work resulted in the first molecular detection and successful isolation of WNV from a wild raptor (Accipiter gentilis) in Portugal after two decades of molecular silence. Full-genome sequencing of the isolate (lineage 1a) was achieved through a conjoined Illumina–Nanopore sequencing approach, enabling its genetic characterization and phylogenetic/phylogeographic reconstructions that suggested the introduction in Portugal of its recent ancestor from West Africa via southern Spain. Recovered serological data also revealed a transitional pattern of WNV dissemination across municipalities over the studied period. Furthermore, nine equine sera displayed neutralizing activity against SINV and WEEV, providing preliminary evidence of Alphavirus circulation. Together, these findings strengthen the case for integrated, longitudinal, multi-pathogen surveillance to improve early detection, outbreak prevention, and development of effective control strategies against emerging arboviral threats in Portugal and the wider Mediterranean basin.

Os arbovírus representam uma ameaça crescente para a saúde pública e animal, com a sua incidência e distribuição geográfica em expansão devido às alterações climáticas, mobilidade global, sustentabilidade dos vetores e alterações ecológicas. Situado ao longo da costa mediterrânica e na interseção das rotas migratórias aviárias afro-eurasiáticas, Portugal é particularmente vulnerável à introdução de arbovírus zoonóticos como o vírus do Nilo Ocidental (WNV), Usutu (USUV), Bagaza (BAGV), Sindbis (SINV), vírus da encefalite transmitida por carraças (TBEV) e vírus da febre hemorrágica da Crimeia-Congo (CCHFV). Este estudo teve como objetivo reforçar a vigilância de arbovírus em Portugal através de duas abordagens complementares: pesquisa molecular em diversas matrizes animais por RT-qPCR para deteção destes vírus e do vírus da encefalite equina ocidental (WEEV); ensaios de neutralização em soros de equinos positivos para anticorpos IgM anti-WNV recolhidos entre 2022 e 2024, para quantificação de anticorpos neutralizantes e análise da sua evolução temporal. Apesar de não ter sido possível detetar molecularmente os vírus USUV, BAGV, TBEV, SINV, WEEV e CCHFV, conseguimos detetar e isolar uma estirpe de WNV em Portugal, pela primeira vez em 20 anos, a partir de um açor europeu (Accipiter gentilis). O genoma completo do isolado (linhagem 1a) foi sequenciado através de uma abordagem de sequenciação híbrida Illumina–Nanopore, permitindo a sua caracterização genética e análises filogenéticas/filogeográficas que sugerem a sua recente introdução a partir da África Ocidental via o sul de Espanha. Os dados serológicos obtidos também revelaram um padrão transitório de disseminação de WNV entre municípios ao longo dos últimos anos, e nove soros apresentaram atividade neutralizante contra SINV e WEEV, sugerindo circulação local de Alphavirus. Estes resultados reforçam a importância de uma vigilância integrada, longitudinal e multipatogénica para melhorar a deteção precoce, prevenir surtos e mitigar o risco de arboviroses emergentes em Portugal e na bacia do Mediterrâneo.