Análise dos genes pfcrt, pfmdr1 e pfpm3 associados à resistência a antimaláricos em amostras de Plasmodium falciparum, em São Tomé e Príncipe

Abstract

Em 2022, a malária era endémica em mais de 85 países, causando 249 milhões de casos e 608.000 mortes a nível global, sendo a região africana de OMS a carregar o maior fardo, com 233 milhões de casos, correspondente a 94% dos casos a nível global. A resistência a antimaláricos constitui um dos maiores entraves ao sucesso dos programas de controlo ou eliminação da malária. Em São Tomé e Príncipe (STP), após a implementação de um programa integrado, com um enorme sucesso, nos últimos anos tem-se vindo a verificar um aumento de número casos, no entanto, pouco se sabe sobre o perfil de resistência dos parasitas em circulação nestas ilhas. Assim, neste estudo pretende-se analisar os polimorfismos nos genes pfcrt, pfmdr1 e pfpm3, associados à resistência a vários antimaláricos, através das técnicas de PCR-RFLP para o estudo do SNP no pfmdr1 e qPCR para o estudo CNV do gene pfmdr1 e pfpm3, sequenciação para identificação dos SNPs nos nucleótidos 72, 73, 74, 75 e 76 do gene pfcrt. As amostras analisadas neste trabalho foram colhidas em São Tomé e Príncipe e todas vieram com diagnostico positivo por microscópia ou teste de diagnostico rápido. A colheita foi feita entre 2020, 2021 e 2022, no âmbito das atividades do PNEP, num total de 292 amostras recolhidas em São Tomé em pacientes com idades entre 7 meses e 88 anos. Cerca de 97% (283/292) das amostras analisadas apresentam P. falciparum, 3% (9/292) são negativas, não tendo sido identificada a presença de nenhuma outra espécie. Os nossos resultados confirmam análises previamente reportadas na literatura, indicando uma elevada prevalência dos alelos 86Y, Y184 e 1246Y do gene pfmdr1 associados à resistência à amodiaquina, uma 4-aminoquinolina. Sobretudo um aumento significativo do alelo 1246 Y ao longo dos 3 anos de estudo. Os codões codificantes de tirosina (Y) dos polimorfismos N86Y, Y184F e D1246Y do gene pfmdr1 são fatores bem documentados de redução da sensibilidade do parasita a medicamentos da classe das 4-aminoquinolinas, nomeadamente cloroquina e amodiaquina. 231 amostras foram sequenciadas com sucesso para a análise dos haplótipos associados à região codificante de Pfcrt (72-76). Foram identificados 6 haplótipos: CVIET, CVMNK, CVIKT, CVMKT, CLMNK e CVIEI. Sendo CVIET o mais frequente (95,2%), um resultado expetável uma vez que é o mais dominante entre os parasitas resistentes à cloroquina, em África. Em relação ao aumento de número de cópias do gene pfmdr1, verificou-se que aproximadamente 4% das amostras (11/245; 0.045, 0.023-0.079) apresentaram um aumento de número de cópias no gene pfmdr1, uma prevalência alinhada com os valores observados noutras regiões no Noroeste África. No que se refere ao gene pfpm3, foi efetuada análise em 241 amostras, tendo sido encontradas duplicações numa frequência de 2%. Os resultados deste trabalho serão de relevância para PNEP, tendo em conta o estado de quase fixação do alelo 76T de gene pfcrt assim como a comprovada diminuição da sensibilidade a fármacos da classe das 4-aminoquinolina na qual inclui amodiaquina, informação fundamental de ponto de vista adoção de novo fármaco para o tratamento de malária no País.

In 2022, malaria was endemic in more than 85 countries, causing 249 million cases and 608,000 deaths globally, with the African WHO region bearing the greatest burden, with 233 million cases, corresponding to 94% of cases globally. Antimalarial resistance is one of the major obstacles to the success of malaria control or elimination programs. In São Tomé and Príncipe (STP), after the implementation of an integrated program, with enormous success, in recent years there has been an increase in the number of cases, however, little is known about the resistance profile of the parasites circulating on these islands. Thus, this study aims to analyzed the polymorphisms in the pfcrt, pfmdr1 and pfpm3 genes, associated with resistance to various antimalarials, through the techniques of PCR- RFLP for the study of the SNP in pfmdr1 and qPCR for the CNV study of the pfmdr1 and pfpm3 gene, sequencing for the identification of SNPs in nucleotides 72, 73, 74, 75 and 76 of the pfcrt gene. The samples analyzed in this study were collected in São Tomé and Príncipe and all came with a positive diagnosis by microscopy or rapid diagnostic test. The collection was carried out between 2020, 2021 and 2022, as part of the PNEP activities, in a total of 292 samples collected in São Tomé in patients aged between 7 months and 88 years. About 97% (283/292) of the samples analyzed have P. falciparum, 3% (9/292) are negative, and the presence of no other species has been identified. Our results confirm analyses previously reported in the literature, indicating a high prevalence of the 86Y, Y184 and 1246Y alleles of the pfmdr1 gene associated with resistance to amodiaquine, a 4-aminoquinoline. Above all, a significant increase in the 1246 Y allele over the 3 years of study. The tyrosine (Y) coding codons of the N86Y, Y184F and D1246Y polymorphisms of the pfmdr1 gene are well-documented factors in reducing the sensitivity of the parasite to drugs of the 4-aminoquinoline class, namely chloroquine and amodiaquine. 231 samples were successfully sequenced for the analysis of haplotypes associated with the coding region of Pfcrt (72-76). 6 haplotypes were identified: CVIET, CVMNK, CVIKT, CVMKT, CLMNK and CVIEI. CVIET is the most frequent (95.2%), an expected result since it is the most dominant among chloroquine-resistant parasites in Africa. Regarding the increase in the number of copies of the pfmdr1 gene, it was found that approximately 4% of the samples (11/245; 0.045, 0.023-0.079) showed an increase in the number of copies in the pfmdr1 gene, a prevalence in line with the values observed in other regions in Northwest Africa. Regarding the pfpm3 gene, analysis was carried out on 241 samples, and duplications were found at a frequency of 2%. The results of this work will be of relevance to PNEP, taking into account the state of quasi-fixation of the 76T allele of pfcrt gene as well as the proven decrease in sensitivity to drugs of the 4-aminoquinoline class in which amodiaquine is included, fundamental information from the point of view of the development of the disease.