Validation of ARMS-HRMA for KRAS mutations in tumor and plasma samples from pancreatic cancer patients

Abstract

Pancreatic cancer (PC) has proved to be a difficult disease to diagnose and treat. The lack of symptoms in the early stages of the disease results in late diagnosis, and the only cura- tive option is the complete resection of the tumor, which in 80% of patients it is not possible. Kirsten rat sarcoma viral oncogene homologue ( KRAS) mutations play a critical role in the car- cinogenesis process and chemoresistant nature of PC, being present in around 90% of pancre- atic ductal adenocarcinomas (PDAC) – the most common form of PC. The molecular characterization of PDAC could prove useful in aiding treatment strategy, as new KRAS targeted therapies have been developed. Liquid biopsies provide a biological fluid to obtain real time information on the tumor’s molecular profile by accessing circulating tumor DNA (ctDNA). However, the low % of ctDNA requires the development of better, high sensitivity molecular detection tools. In this work, the coupling of the Amplification Refractory Mutation System (ARMS) and High-Resolution Melting Analysis (HRMA) methodologies - ARMS-HRMA - was further vali- dated to detect codon 12 and codon 13 KRAS mutations (G12D, G12V, G12R, G12C and G13D) in tumor and plasma samples. In a cohort of 97 pancreatic cancer patients, ARMS-HRMA was successfully performed in 93 tumor samples, where 72 out of 93 tested positive for KRAS mu- tations (77%). Out of the 72 positive cases, 35 were G12D (49%), 22 were G12V (31%), 10 were G12R (14%), 1 were G12C (1%), 1 were G13D (1%), 2 were positive for both G12D and G12V (3%) and 1 was positive for both G12C and G12D (1%). Sanger Sequencing (SS), the current gold standard for mutation analysis, only detected KRAS mutations in 52 out of 97 tumor sam- ples (54%). ARMS-HRMA detected every KRAS mutation described by SS, while showing im- proved sensitivity and maintaining specificity. 20 out of 65 plasma samples (31%) presented the same KRAS mutation as their corresponding tumor samples when analyzed by ARMS- HRMA. As a simple, rapid and cheap technique, ARMS-HRMA is a promising tool for the man- agement of PDAC, not only by allowing the molecular characterization of pancreatic tumors, but also by improving disease monitoring through the detection of KRAS mutations in ctDNA.

O cancro do pâncreas (CP) é uma doença difícil de diagnosticar e tratar. A ausência de sintomas nas fases iniciais da doença resulta num diagnóstico tardio, e a única opção curativa é a ressecção completa do tumor, o que em 80% dos doentes não é possível. Mutações no gene Kirsten rat sarcoma viral oncogene homologue ( KRAS) desempenham um papel crítico no processo de carcinogénese e na natureza quimiorresistente do CP, estando presentes em cerca de 90% dos adenocarcinomas ductais pancreáticos (ACDP) - a forma mais comum de CP. A caracterização molecular de ACDP pode ser útil a escolher a estratégia de tratamento, visto que novas terapias direcionadas a KRAS foram desenvolvidas. As biópsias líquidas for- necem fluidos biológicos onde é possível obter informação em tempo real sobre o perfil mo- lecular do tumor, ao analisar DNA tumoral circulante (ctDNA). No entanto, a baixa % de ctDNA requer o desenvolvimento de melhores ferramentas de deteção molecular de alta sensi- bilidade. Neste trabalho, o acoplamento das metodologias Amplification Refractory Mutation Sys- tem (ARMS) e High-Resolution Melting Analysis (HRMA) - ARMS-HRMA - foi validado para detetar mutações no gene KRAS nos codões 12 e 13 (G12D, G12V, G12R, G12C e G13D) em amostras de tumor e de plasma. Numa coorte de 97 doentes com CP, ARMS-HRMA foi real- izado com sucesso em 93 amostras de tumores, onde 72 (77%) apresentaram mutações no gene KRAS. Destas 72 amostras, a mutação G12D foi detetada em 35 (49%), G12V em 22 (31%), G12R em 10 (14%), G12C numa (1%), G13D numa (1%), G12D e G12V em 2 (3%) e 1 uma testou positivo para G12C e G12D (1%). A Sequenciação de Sanger (SS), a atual técnica de referência para análise de mutações, detetou apenas mutações no gene KRAS em 52 das 97 amostras de tumores (54%). ARMS-HRMA detetou todas as mutações no KRAS descritas pela SS, mon- strando melhor sensibilidade e manutendo a especificidade. Vinte das 65 amostras de plasma (31%) apresentaram a mesma mutação que as amostras de tumor correspondentes quando analisadas por ARMS-HRMA. Por ser uma técnica simples, rápida e barata, a ARMS-HRMA é uma ferramenta promissora para a gestão de ADCP, não só por permitir a caracterização mo- lecular de tumores do pâncreas, mas também por melhorar a monitorização da doença através da deteção de mutações no KRAS em ctDNA.