Nanoheaters – Localized hyperthermia for precise gene delivery

Abstract

Gene therapy relies on the precise transfection of nucleic acid effectors into cancer cells, such as small interfering RNA (siRNA) and antisense oligonucleotides (ASO). Therefore, novel

therapeutic approaches are widely needed to deliver silencing moieties with maximal trans- fection efficiency and minimal toxicity. This thesis explored the use of mild hyperthermia me- diated by gold nanoparticles (AuNPs) or magnetic nanoparticles (MNPs) to enhance nucleic

acids delivery with spatiotemporal control over laser irradiation or magnetic modulation, re- spectively.

First, the photothermal effect of AuNPs under visible light irradiation was verified, leading to enhanced cellular uptake. The potential of mild photothermy via AuNPs was demonstrated by effectively silencing the GFP gene in colorectal carcinoma cell line (HCT116) and breast adenocarcinoma cell line (MCF-7), with comparable gene silencing efficiency to commercial transfection reagent, but without cytotoxicity. Improving gene silencing strategies in 3D cell cultures is important since it provides in vitro models that closely resemble the in vivo tumor microenvironment (TME). Then, it was shown that mild photothermy mediated by AuNPs functionalized with ASO decreases c-MYC oncogene expression in HCT116 cells and 7-day spheroids, respectively.

Localized magnetic hyperthermia mediated by immobilized MNPs on the cell mem- brane through bioorthogonal chemistry improves the transfection of anti-GFP in MCF-7 cells,

with similar efficacy and less cytotoxicity compared to standard transfection reagent. Taking

advantage of this approach, an effective IDO1 gene silencing was obtained through the trans- fection of siRNA in dendritic cells derived from an acute monocytic leukemia cell line (THP- 1). Moreover, the upregulation of pro-inflammatory cytokines IL6, TNFA, and IL12 genes and

the downregulation of anti-inflammatory IL10 gene might contribute to a more immunogenic state in a TME context. In summary, this thesis highlights nanoparticle-mediated mild hyperthermia as a promising strategy for controlled and efficient nucleic acids delivery that might pave the way for improved gene therapy applications in more complex cancer models.

A terapia genética depende da transfeção precisa de ácidos nucleicos nas células can- cerígenas, como small interfering RNA (siRNA) e oligonucleotidos antisense (ASO). Novas abor- dagens terapêuticas são extremamente necessárias para uma transfeção eficiente com toxici- dade reduzida. Esta tese explorou o uso de hipertermia leve mediada por nanopartículas de

ouro (AuNPs) ou nanopartículas magnéticas (MNPs) para melhorar a entrega de ácidos nu- cleicos com controlo espácio-temporal sob irradiação laser ou modulação magnética, respeti- vamente.

Foi primeiro verificado o efeito fototermal de AuNPs sob irradiação de luz visível, que

levou ao aumento do uptake celular. O potencial da fototermia leve via AuNPs foi demons- trado ao silenciar o gene GFP nas linhas de carcinoma colorretal (HCT116) e adenocarcinoma

da mama (MCF-7), com eficiência de silenciamento comparável ao reagente comercial para

transfeção, mas sem citotoxicidade. Melhorar as estratégias de silenciamento genético em cul- turas celulares 3D é importante, uma vez que são modelos in vitro que melhor se assemelham

ao microambiente tumoral (TME) in vivo. Assim sendo, foi observado que a fototermia leve mediada por AuNPs funcionalizadas com ASO diminuiu a expressão do oncogene c-MYC em células HCT116 e esferoides de 7 dias, respetivamente.

Hipertermia magnética localizada mediada por MNPs imobilizadas na membrana ce- lular através de química bio-ortogonal melhorou a transfeção de anti-GFP nas células MCF-7

com eficiência e menos citotoxicidade que o reagente comercial. Através desta estratégia, foi

obtido o silenciamento do gene IDO1 após a entrega de siRNA em células dendríticas deriva- das de uma linha celular de leucemia monocítica aguda (THP-1). Além disso, o aumento da

expressão genética das citocinas pró-inflamatórias IL6, TNFA e IL12 e a diminuição da anti- inflamatória IL10 podem contribuir para um estado mais imunogénico no contexto do TME.

Em resumo, esta tese destaca a hipertermia leve mediada por nanopartículas como uma estratégia promissora para a entrega controlada e eficiente de ácidos nucleicos, o que pode abrir caminho para novas aplicações de terapia genética em modelos de cancro mais complexos.