ENHANCING THE STORAGE STABILITY OF BIOTHERAPEUTICS USING NATURAL DEEP EUTECTIC SYSTEMS

Abstract

The preservation and equal distribution of biotherapeutics worldwide is hindered by several constraints such as high processing costs, the dependence of the cold chain, the lack of stability of liquid formulations or even the short shelf life that is currently achieved. Hence, this work aimed at developing strategies that increase products’ shelf life or even decrease the dependence of the cold chain for preservation. Herein, the stabilisation of different biomolecules using natural deep eutectic systems (NADES) was studied, starting from the simplest, ascorbic acid (AA), moving to more complex structures, such as proteins, and finally cells. The chosen compounds can either have therapeutic application or be used to produce biotherapeutics. Considering the stabilization of AA, using a NADES composed of betaine and citric acid, it was possible to maintain AA’s high antioxidant activity up to 9 days, while the control was only active for 2 days. Moreover, this system showed no toxicity against Palaemon varians. The NADES+AA formulations were tested for the preservation of fruits, being more efficient than AA alone. The activation and thermostability of horseradish peroxidase (HRP) were also studied. It was concluded that upon incubation on betaine-based NADES, HRP was more active, and would acquire a more stable conformation, confirmed by an increase of its unfolding temperature. The enzyme also become thermostable, up to 80 °C when incubated in a NADES composed of betaine, trehalose, and glycerol. The more active and stable HRP was then used to prepare enzymatically crosslinked eutectogels. In comparison to regular hydrogels, these were more stable and had better rheological properties. The eutectogels were used to successfully prepare drug delivery systems of ketoprofen. The final chapter of this work, focused on the application of NADES as additives for the preservation of red blood cells (RBC). Our study allowed to conclude that, in the conditions tested, NADES were as effective as the standard solution currently used in Europe.

A preservação e distribuição de fármacos a nível global continua a ser limitada por diversos fatores como o elevado custo das técnicas de processamento, a dependência da cadeia de frio, a falta de estabilidade de formulações líquidas e até mesmo o limite de validade que é possível atingir. Deste modo, o principal objetivo deste trabalho foi desenvolver estratégias que permitam prolongar o prazo de validade destes produtos ou até reduzir a necessidade de recorrer ao uso da cadeia de frio para preservação. Assim, estudou-se a preservação de biomoléculas com solventes eutécticos naturais (NADES), começando por moléculas simples, como o ácido ascórbico (AA) e avançando para estruturas mais complexas como proteínas e também células. Os compostos testados podem ter aplicação terapêutica ou ser usados na produção de biofármacos. Através da dissolução do AA num NADES composto por betaína e ácido cítrico, foi possível prolongar a sua atividade antioxidante até 9 dias em solução, em comparação com apenas 2 dias no controlo. Também se estudou o perfil toxicológico dos NADES em Palaemon varians, permitindo concluir que, nas concentrações testadas os sistemas não são tóxicos. As mesmas formulações de NADES+AA foram testadas para a preservação de frutas, tendo sido mais eficazes do que a solução de AA. Outro tópico de estudo foi a ativação e estabilidade da enzima peroxidase de rábano (HRP). A sua incubação num NADES à base de betaína permitiu, não só, aumentar a atividade enzimática, mas também conferir uma estrutura mais estável à enzima, aumentando a sua temperatura de desnaturação e, consequentemente a sua estabilidade a temperaturas mais elevadas (80 °C). A HRP mais ativa e estável foi depois usada na preparação de eutectogéis, por crosslinking enzimático. Em comparação com hidrogéis tradicionais, os eutectogéis obtidos eram mais estáveis, apresentando também melhores propriedades mecânicas. Estes géis foram também usados como sistemas de libertação controlada de cetoprofeno. No capítulo final deste trabalho, testou-se a utilização de soluções à base de NADES para a conservação de eritrócitos. Os resultados obtidos permitiram concluir que, nas condições testadas, os NADES provaram ter a mesma eficácia que a solução atualmente autorizada para uso na Europa.