Avaliação da atividade e eficácia de fármacos propostos a reposicionamento contra Staphylococcus aureus E Staphylococcus epidermidis

Abstract

RESUMO: Staphylococcus aureus e Staphylococcus epidermidis são agentes patogénicos clinicamente relevantes, frequentemente associados a infeções resilientes a terapêutica devido à capacidade de desenvolver e/ou adquirir mecanismos de resistência, como os sistemas de efluxo e a formação de biofilme, o que dificulta a terapêutica das infeções. Diversos estudos sugerem uma possível associação entre os sistemas de efluxo e a formação de biofilme. A amlodipina (AML), sunitinib (SUN) e labetalol (LAB) foram previamente identificados in silico e propostos a reposicionamento como inibidores de efluxo (IEs) e agentes antibiofilme em S. aureus e S. epidermidis. O objetivo deste estudo foi validar a atividade destes fármacos, previamente explorada em análises preliminares em estirpes de referência, in vitro e in vivo num modelo de infeção larval de Galleria mellonella. A atividade inibitória de efluxo de cada fármaco foi avaliada com base na sua capacidade de (i) reduzir a concentração mínima inibitória (CMI) da ciprofloxacina (CIP), brometo de etídeo (EtBr) e do brometo tetrafenilfosfónio (TPP), substratos da bomba de efluxo NorA, através do método de microdiluição, e (ii) por ensaios fluorométricos de acumulação de EtBr. O efeito sinérgico fármaco + substrato de NorA foi avaliado através de ensaios de checkerboard e time-kill. A atividade antibiofilme dos fármacos foi analisada em ensaios de adesão em microplaca com coloração por violeta de cristal. A eficácia do fármaco mais promissor foi avaliada no modelo de infeção de G. mellonella, incluindo (i) ensaios toxicológicos para determinar a dose letal (LD50), (ii) determinação da dose infeciosa bacteriana e (iii) eficácia no tratamento de infeção por S. aureus. A atividade inibitória de efluxo dos fármacos foi comprovada, ao reduzirem >4X CMICIP, CMIEtBr e CMITPP e, nos ensaios de acumulação de EtBr, apresentarem valores de fluorescência relativa final (RFF) ≥ 1 para estirpes clínicas de ambas as espécies. Adicionalmente, os fármacos demonstraram atividade antibiofilme reduzindo em >50% a produção de biofilme em estirpes de S. aureus e S. epidermidis. O SUN e a AML apresentaram as menores concentrações mínimas efetivas associadas a inibição de efluxo e/ou atividade antibiofilme (16 – 64 mg/L). Em contrapartida, nos ensaios de time-kill, a AML quando combinada com a CIP em diferentes concentrações, não apresentou efeito sinérgico. Os fármacos apresentaram baixa toxicidade em G. mellonella (LD50 SUN: > 1000 mg/Kg; AML: > 640 mg/Kg; LAB: 1098 mg/Kg). A dose infeciosa para estirpes de S. aureusfoi 107 UFC/mL. A AML a 1,5 mg/Kg aumentou em 17% a probabilidade de sobrevivência da população larvar infetada por S. aureus ATCC25923_EtBr. Em suma, o trabalho demonstrou que a AML, SUN e LAB são IEs e agentes antibiofilme em estirpes de S. aureus e S. epidermidis com interesse clínico, à exceção do SUN que apenas apresenta atividade antibiofilme em S. epidermidis. Os ensaios de eficácia da AML mostraram um efeito moderado deste fármaco no tratamento da infeção por S. aureus em G. mellonella. Este trabalho sugere que estes fármacos poderão ser modelos para o desenvolvimento de novos fármacos com maior eficácia no tratamento de infeções por estes agentes patogénicos.

ABSTRACT: Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis are clinically relevant pathogens, frequently associated with difficult-to-treat infections due to their ability to develop and/or acquire resistance mechanisms, including efflux systems and biofilm formation. Several studies suggest a potential link between efflux systems and biofilm production, which complicates treatment strategies. The drugs amlodipine (AML), sunitinib (SUN) and labetalol (LAB) were previously identified in silico and proposed for repurposing as efflux inhibitors (IEs) and antibiofilm agents against S. aureus e S. epidermidis. The aim of this study was to validate the activity of these drugs, previously explored in preliminary analysis in reference strains in vitro and in vivo in a Galleria mellonella larval infection model. The efflux inhibitory activity of each drug was assessed by (i) determining the reduction in the minimal inhibitory concentration (MIC) of ciprofloxacin (CIP), ethidium bromide (EtBr) and tetraphenylphosphonium bromide (TPP), substrates of the NorA efflux pump, using the microdilution method and (ii) fluorometric EtBr accumulation assays. The synergistic effects drug + NorA substrate were examined via checkerboard and time-kill assays. The antibiofilm activity of the drugs was assessed using microplate adhesion assays with crystal violet staining. Efficacy was further evaluated in the G. mellonella infection model, including (i) toxicological assays for determining the drug’s lethal dose (LD50), (ii) the bacterial infectious dose, and the (iii) effectiveness of the drugs in treating infection by S. aureus. The drug´s inhibitory activity was verified, by observing >4X reductions in MICCIP, MICEtBr and MICTPP and, in EtBr accumulation assays, by showing relative final fluorescence (RFF) values ≥ 1 for clinical strains of both species. Additionally, the drugs demonstrated antibiofilm activity by reducing biofilm formation by > 50% in S. aureus and S. epidermidis strains. SUN and AML presented the lower effective concentrations associated with efflux inhibition and/or antibiofilm activity (16 – 64 mg/L). However, in time-kill assays, AML showed no synergistic effect when combined with CIP. The drugs presented low toxicity in G. mellonella (LD50 SUN: > 1000 mg/Kg; AML: > 640 mg/Kg; LAB: 1098 mg/Kg). The infectious dose for S. aureus strains was 107 CFU/mL. AML at 1.5 mg/Kg increased by 17% the survival probability of the larval population infected by S. aureus ATCC 25923_EtBr. In conclusion, AML, SUN, and LAB are IEs and antibiofilm agents against clinically relevant strains of S. aureus and S. epidermidis, except for SUN which only presented antibiofilm activity in S. epidermidis. The AML efficacy assays showed a moderate effect in the treatment of G. mellonella infected by S. aureus. This work suggest that these drugs may be lead compounds for the development of new drugs with increased efficacy in the treatment of infections caused by these pathogens.