Caracterização molecular da resistência aos antimicrobianos e genotipagem de mycoplasma genitalium em amostras positivas da área de Lisboa

Abstract

Resumo: Mycoplasma genitalium é uma bactéria sexualmente transmissível responsável por uretrites e cervicites, tendo vindo a ser associada a casos de infertilidade, doença inflamatória pélvica e proctite. O diagnóstico destas infeções realiza-se através de técnicas de biologia molecular, nomeadamente testes de amplificação de ácidos nucleicos, devido ao crescimento fastidioso desta bactéria. O tratamento encontra se, essencialmente, restrito a macrólidos e fluoroquinolonas, mas tem-se registado o surgimento de casos de resistência, conferida por mutações nos genes 23S rDNA e parC/gyrA, respetivamente. Desta forma, M. genitalium posiciona-se, atualmente, como uma séria ameaça à saúde pública. Assim, esta dissertação teve como objetivo estudar a prevalência de marcadores moleculares associados a resistência aos macrólidos e às fluoroquinolonas, em amostras de doentes de um hospital da área de Lisboa colhidas entre janeiro de 2022 e fevereiro de 2023. Para além disto, pretendeu-se também determinar a diversidade genética de estirpes de M. genitalium, que circulam nesta região. Realizou-se a extração de DNA de 78 amostras com identificação positiva para esta bactéria, seguindo-se a avaliação do perfil molecular de suscetibilidade a macrólidos e fluoroquinolonas através de sequenciação de Sanger de regiões de interesse dos genes 23S rDNA, parC e gyrA, de forma a averiguar a presença ou ausência de mutações associadas a resistência. Realizou-se também uma técnica de PCR em tempo real, com recurso a uma sonda com uma sequência selvagem para duas posições de interesse do gene 23S rDNA, permitindo diferenciar presuntivamente amostras com DNA de M. genitalium suscetível ou resistente a macrólidos. A tipagem molecular das amostras foi efetuada através de sequenciação de Sanger da região de interesse do gene mgpB. A técnica de PCR em tempo real demonstrou que potencialmente 69,2% (54/78) das amostras apresentava a região de interesse do gene 23S rDNA na forma não selvagem. Segundo os resultados da sequenciação de Sanger, 62,8% (49/78) das amostras revelaram mutações associadas a resistência aos macrólidos, correspondendo às alterações A2059G (n=23), A2058G (n=19) e A2058T (n=7). No caso das mutações associadas a resistência às fluoroquinolonas, estas foram detetadas em 17,9% (14/78) das amostras, correspondendo às alterações aminoacídicas S83I (n=8), D87N (n=4) e D87Y (n=2). Estes dados permitiram classificar 15,4% (12/78) das amostras como potencialmente multirresistentes. A tipagem molecular permitiu identificar 22 tipos de mgpB diferentes, sendo os alelos 4 (17,2%) e 105 (15,6%) os mais detetados, o que revelou emergência policlonal de resistência aos macrólidos e às fluoroquinolonas. Para concluir, cerca de 2/3 das amostras analisadas neste estudo possuíam mutações associadas a resistência aos macrólidos, tornando imperativo a implementação da pesquisa destas mutações na rotina laboratorial. O aparecimento de mutações associadas a resistência às fluoroquinolonas começa a tornar-se preocupante, o que implica que seja feita uma melhor gestão dos antibióticos disponíveis, ou seja, que se utilizem fluoroquinolonas ou antibióticos de terceira linha apenas para casos estritamente necessários.

Abstract: Mycoplasma genitalium is a sexually transmitted bacteria responsible for urethritis and cervicitis and it has been associated with infertility, pelvic inflammatory disease or proctitis. Due to the fastidious growth of this bacteria, the diagnosis of these infections is carried out through molecular biology techniques, namely nucleic acid amplification tests. Treatment of these infections is essentially restricted to macrolides and fluoroquinolones, but the emergence of resistance to these antibiotics has been reported, conferred by mutations in the 23S rDNA and parC/gyrA genes, respectively. Therefore, M. genitalium is currently a serious threat to public health. Thus, the aim of this dissertation was to study the prevalence of molecular markers associated with resistance to macrolides and fluoroquinolones in samples from patients from a Lisbon area hospital collected between January 2022 and February 2023. It was also decided to study the genetic diversity of M. genitalium strains that are circulating in this region. DNA extraction was performed for 78 samples with positive identification for this bacterium, followed by the evaluation of the molecular susceptibility profile to macrolides and fluoroquinolones through Sanger sequencing of regions of interest from genes 23S rDNA, parC and gyrA, in order to evaluate the presence or absence of resistance associated mutations. We also performed a real time PCR technique with a wild-type probe for two positions of interest in 23S rDNA gene, allowing a presumptive differentiation of samples with DNA of macrolide susceptible or resistant M. genitalium. Molecular typing of the samples was carried out through Sanger sequencing of a region of interest of the mgpB gene. The real time PCR technique demonstrated that potentially 69.2% (54/78) of samples presented the 23S rDNA region of interest in the non-wild type form. According to the results of Sanger sequencing, 62.8% (49/78) of the samples revealed macrolide resistance associated mutations, corresponding to the alterations A2059G (n=23), A2058G (n=19) and A2058T (n=7). Regarding to fluoroquinolone resistance associated mutations, these were detected in 17.9% (14/78) of the samples, corresponding to the amino acid alterations S83I (n=8), D87N (n=4) and D87Y (n=2). These results allowed the classification of 15.4% (12/78) of the samples as potentially multidrug resistant. The molecular typing identified 22 different types of mgpB, with the alleles 4 (17.2%) and 105 (15.6%) as the most common, which revealed a polyclonal emergence of macrolide and fluoroquinolone resistance. To conclude, approximately 2/3 of the samples analyzed in this study presented macrolide resistance associated mutations, making it imperative to implement the search for these mutations in the laboratory routine. The emergence of fluoroquinolone resistance associated mutations is becoming worryingly, which implies that better management of the available antibiotics should be carried out, meaning that fluoroquinolones or third-line antibiotics should only be used when strictly necessary.