Cytochromes in Geobacter: fostering sustainable sources of energy production

Abstract

Geobacter bacteria congregate interesting features for application in sustainability: they are able to couple the oxidation of toxic organic compounds, such as toluene, to the reduction of Fe(III) and toxic Mn(IV), Cr(III), U(VI). Furthermore, they can associate with electrodes in Microbial Fuel Cells (MFC) to produce electrical energy. These features are possible because of the chain of multiheme cytochromes poised at the different cellular compartments that relay the electrons to the cell’s exterior – Extracellular Electron Transfer (EET). The applications are promising but challenges still lay ahead, especially since the EET chain components and their interactions are not well-characterized. This work focused on three main aspects of Geobacter – exploration of long-range ET; assessment of redox partnership in the context of oxidative stress; manipulation of the redox properties of cytochromes. In the long-range ET realm, we studied the redox partnership of triheme periplasmic cytochromes PpcA-E with native OmcS nanowires and determined for the first time that PpcA-E can directly provide reducing power to OmcS, clarifying this ET route. We worked on the heterologous expression system in E. coli for OmcZ and OmcS to, respectively, improve it and develop it to, in the future, facilitate sample obtention for biochemical studies. In the context of oxidative stress, we determined that PpcA-E provide reducing power to MacA peroxidase, specifically to its HP heme, elucidating this redox partnership. The role of PpcA-family periplasmic cytochromes is pivotal in various ET pathways and, as such, we studied how their redox properties can be manipulated to fine tune the ET directionality of future Geobacter-engineered strains with minimal components. Using protein engineering and PpcA from G. metallireducens as a framework, we have shifted its midpoint reduction potential value 71% towards the one of PpcA from G. sulfurreducens. These studies contributed to the elucidation of two redox partnerships important in Geobacter’s ET chain, to the establishment of the foundations for the heterologous overexpression of two nanowires, and to the creation of a mutants’ library of PpcA periplasmic cytochromes, a pivotal component of the ET chain.

As bactérias do género Geobacter possuem várias características promissoras para aplicações sustentáveis: acoplam a oxidação de compostos orgânicos, como o tolueno, à redução de Fe(III) e compostos tóxicos como o Mn(IV), Cr(III) e U(VI). Também se associam a elétrodos em Células de Combustível Microbiano (CCM) para produzir energia elétrica. Estas características advêm da sua cadeia de citocromos multihémicos: localizados nos diferentes compartimentos celulares, os citocromos asseguram a transferência eficaz dos eletrões para o exterior celular – Transferência de Eletrões Extracelular (TEE). Embora as aplicações sejam promissoras, os desafios são ainda muitos uma vez que os citocromos da cadeia de TEE e as interações estabelecidas entre eles ainda não se encontram totalmente caracterizadas. A fim de contribuir para a melhor compreensão da TEE, neste trabalho investigaram-se: os mecanismos de TEE a longas distâncias; parcerias redox estabelecidas no contexto de stress oxidativo; manipulação das propriedades redox do citocromo PpcA. Relativamente aos mecanismos de TEE a longas distâncias, estudou-se a parceria redox entre os citocromos trihémicos periplasmáticos PpcA- E e os nanowires nativos do citocromo OmcS tendo-se determinado, pela primeira vez, que os citocromos PpcA-E doam eletrões aos nanowires do OmcS. A fim de facilitar a obtenção de amostra de nanowires OmcZ e OmcS a partir da expressão heteróloga em E. coli, melhorou-se e desenvolveu-se, respetivamente, o sistema de expressão destas proteínas. No contexto do stress oxidativo, determinou-se que os citocromos PpcA-E transferem eletrões para a peroxidase MacA, especificamente para o seu hemo HP. Utilizando mutagénese dirigida, obteve-se um mutante do PpcA de G. metallireducens cujo potencial se assemelha em 71% ao do PpcA de G. sulfurreducens. Uma vez que os citocromos PpcA-E são essenciais na cadeia de TEE, a manipulação das suas propriedades redox poderá contribuir para aumentar a direccionalidade e eficiência da TEE em estirpes de Geobacter geneticamente modificadas. Em suma, este trabalho contribuiu para a elucidação de duas importantes parcerias redox na cadeia de TEE de G. sulfurreducens, para a identificação de condições promissoras para a expressão heteróloga de dois nanowires e para a criação de uma coleção de mutantes do citocromo periplasmático PpcA, um elemento essencial na cadeia de TEE.