Caracterização Bioquímica da ApbE recombinante de Marinobacter nauticus

Abstract

O óxido nitroso, um gás de efeito de estufa com uma percentagem de emissão relativa- mente baixa, possui um tempo de vida atmosférica de aproximadamente 120 anos e um po- tencial de aquecimento global cerca de 300 vezes superior ao do dióxido de carbono. O óxido nitroso contribui ainda para o aquecimento global por reagir com o ozono diminuindo a ca- mada de ozono. A N2OR, a única enzima capaz de reduzir o N2O a N2, necessita in vitro de ser ativada através de redução prolongada com viologénio de metilo reduzido. Uma outra prote- ína codificada no mesmo operão que a N2OR, designada de NosR, poderá ter essa função in vivo. A NosR é uma proteína membranar com vários centros Fe/S, e um domínio periplasmá- tico com um grupo FMN ligado à cadeia polipeptídica através de um resíduo de treonina. Neste trabalho, será isolada e caracterizada bioquimicamente a ApbE de Marinobacter nauticus, responsável pela introdução do grupo FMN na NosR. A ApbE recombinante de M. nauticus foi purificada utilizando uma cromatografia de afinidade Ni-NTA, com um rendi- mento de 25 mg/L de cultura. A obtenção de holo-proteína (contendo o grupo FAD) foi oti- mizada testando-se diferentes condições de incubação apo-ApbE: FAD bem como diferentes condições de crescimento onde o FAD ou a riboflavina foram adicionados tendo-se concluído que a maior proporção FAD/proteína (0,68:1) é obtida quando o FAD é adicionado durante a ressuspensão das células após o crescimento celular, e antes da lise celular. O seu espectro de UV-visível apresenta máximos de absorção a 368 nm e a 454 nm, características de uma fla- voproteína que liga FAD. O espectro de CD na região far-UV mostrou que a ApbE na sua forma holo e apo estão folded, e estimou-se que o conteúdo de estrutura secundária é de 19 % e 34 %, de hélices-a e folhas-b, respetivamente para a ApbE isolada (holo), e de 26 % e 24 % de hélices-a e folhas-b, respetivamente para a apo-ApbE. O espectro de CD da holo-ApbE na região do visível apresenta máximos a 348 nm e 418 nm, e mínimos a 375 nm e 490 nm. A termoestabilidade da ApbE foi estudada por CD na região far-UV, comparando a pro- teína isolada com FAD, com a apo-ApbE. Estes estudos mostraram que a presença de FAD não influencia a sua termostabilidade e que a temperatura de desnaturação é de 50 °C

Nitrous oxide, a greenhouse gas with a relatively low emission percentage, has an at- mospheric lifetime of around 120 years and a global warming potential around 300 times greater than that of carbon dioxide. Nitrous oxide also contributes to global warming by re- acting with ozone and depleting the ozone layer. N2OR, the only enzyme capable of reducing N2O to N2, needs to be activated in vitro by prolonged reduction with reduced methyl vio- logen. Another protein encoded in the same operon as N2OR, called NosR, may have this func- tion in vivo. NosR is a transmembrane protein with several Fe/S centres and a periplasmic domain with an FMN group attached to the polypeptide chain via a threonine residue. In this work, the recombinant ApbE from Marinobacter nauticus, responsible for intro- ducing the FMN group into NosR, will be isolated and biochemically characterised. The re- combinant ApbE from M. nauticus was purified using Ni-NTA affinity chromatography, with a yield of 25 mg/L of culture. Obtaining the holo-protein (containing the FAD group) was optimised by testing different apo-ApbE:FAD incubation conditions as well as different growth conditions where FAD or riboflavin were added. It was concluded that the highest FAD/protein ratio (0.68:1) is obtained when FAD is added during cell resuspension after cell growth and before cell lysis. Its UV-visible spectrum shows absorption maxima at 368 nm and 454 nm, which are characteristic of a flavoprotein that binds FAD. The CD spectrum in the far- UV region showed that both isolated ApbE and apo-ApbE are folded, and it was estimated that the secondary structure content is 19 % and 34 %, of α-helices and β-sheets, respectively for isolated ApbE, and 26 % and 24 % of α-helices and β-sheets, respectively for apo-ApbE. The CD spectrum of holo-ApbE in the visible region shows maxima at 348 nm and 418 nm, and minima at 375 nm and 490 nm. The thermostability of ApbE was studied by CD in the far-UV region, comparing the protein isolated with FAD with apo-ApbE. These studies showed that the presence of FAD does not influence its thermostability and that the denaturation temperature is 50 ºC.